מוטציה הומוזיגוטית ב-SLC1A4 בקרב אחים בעלי מגבלה אינטלקטואלית חמורה ומיקרוצפליה
מ. סרור1,2, פ. פ. המדאן2, ז. גן-אור3,4, ד. לבודה2,5, ס. נסיף2, מ. אוסקווי1, מ. גנה ווייז6, א. אורטרגר6,7, ג. א. רוולאו3,4,8 ו-ג’. ל. מיקאווד2,5,9
1 המחלקה לנוירולוגיית ילדים, בית החולים לילדים במונטריאול, המרכז הרפואי של אוניברסיטת מקגיל, מונטריאול, קנדה
2 המרכז למחקר “CHU Sainte-Justine”, מונטריאול, קנדה
3 “Montreal Neurological Institute”, אוניברסיטת מקגיל, מונטריאול, H3A 2B4, קנדה
4 המחלקה לגנטיקה אנושית, אוניברסיטת מקגיל, מונטריאול, קנדה
5 המחלקה לרפואת ילדים, אוניברסיטת מונטריאול, מונטריאול, קנדה
6 המכון לגנטיקה, המרכז הרפואי “סוראסקי”, תל אביב, תל אביב, ישראל
7 הפקולטה לרפואה על-שם סאקלר, אוניברסיטת תל אביב, תל אביב, ישראל
8 המחלקה לנוירולוגיה ולנוירו-כירורגיה, אוניברסיטת מקגיל, מונטריאול, קנדה
9 המחלקה למדעי המוח, אוניברסיטת מונטריאול, מונטריאול, קנדה
ליצירת קשר עם הכותב: ז’קו ל. מיקאווד, המרכז למחקר “CHU Sainte-Justine”, 3175, Côte Sainte-Catherine, מונטריאול, קוויבק, קנדה, H3T 1C5.
טלפון: +1 514) 345 4931×6900
פקס: +1 514) 345 4766
אימייל: jacques.michaud@recherche-ste-justine.qc.ca
התקבל ב-20 במרץ 2015, תוקן והותר לפרסום ב-27 באפריל 2015
מילות מפתח: יהודים אשכנזים, סידור האקסונים ברצף, מגבלה אינטלקטואלית, מיקרוצפליה, חומצת אמינו ניטרלית, SLC1A4
הקדמה
ביצענו ניתוח אקסונים בקרב שני אחים פגועים בעלי מגבלה אינטלקטואלית חמורה (ID), מיקרוצפליה וספסטיות, אשר המשפחה הקרובה שלהם יהודית אשכנזית. זיהינו משתנה נדיר אחד בלבד, הקשור להחלפת חומצות אמינו, ב- SLC1A4(c. 766G>A (p. E256K)), אשר הוא הומוזיגוטי בקרב שני האחים, אך לא בקרב אף אחד מ-11 האחים שלהם, שאינם פגועים, או בקרב ההורים שלהם (לוגריתם הסתברות: ציון LOD:2.6). משתנה זה מנובא כמזיק. חקרנו את הגנטיקה של 450 חברי קבוצת ביקורת ממוצא יהודי אשכנזי וזיהינו אך ורק 5 פרטים הטרוזיגוטיים למשתנה זה (שכיחות אלל מינורי: 0.0056). Sב-LC1A4 (ASCT1) מקודד מוביל לחומצות אמינו ניטרליות, כגון אלנין, כגון סרין, כגון ציסטאין וכגון תראונין.
סרין-L נחוץ להישרדות הנוירונים ולהבדלה ביניהם. בעצם, הפרעות בביו-סינתזה של ה-סרין-L משפיעות על התפתחות המוח וגורמות ID חמור. במוח עובר סרין-L סינתזה באסטרוציטים, אבל לא בנוירונים. הוצע, כי ASCT1 מתווך בין ספיגת סרין-L בנוירונים לבין שחרור glia-borne l-serine לתאים שכנים. לכן עלול שיבוש ב- SLC1A4להפריע להתפתחות המוח ולתפקודו על-ידי הפחתת רמות ה-סרין-L בנוירונים. איתור משפחות נוספות, אשר נושאות את המוטציה ב- SLC1A4, אמור להידרש לאישור המעורבות שלה ב-ID.
דיווח על מקרה קליני
שני האחים הפגועים ((II.8 (S16004 ו- II.12 (S16005))), אשר תוארו בזאת, נולדו לבני דודים יהודים אשכנזים מדרגה ראשונה. יש להם אחים אחרים רגילים (תרשים 1S, a, מידע תומך). הנתונים הקליניים של שני המטופלים הוכנסו ל- Phenomecentral (https://phenomecentral.orq/ P0001063and P0001064). הושגה הסכמה מדעת מכל משתתף, או מכל אפוטרופוס, והמחקר אושר על-ידי ועדת האתיקה של ה- the CHU Sainte-Justine (מונטריאול, קנדה).
מטופלת 1
מטופלת 1 (8.II) היא ילדה, אשר נולדה לאחר היריון תקין ולאחר לידה תקינה. בלידה הייתה במוחה כמות נוזלים תקינה. יש לה עיכוב התפתחותי חמור. בגילה הנוכחי, 11, היא אינה מסוגלת ללכת, על אף שהיא מסוגלת לזחול ולעמוד בתמיכה. היא אינה בעלת יכולת מילולית ומבינה רק הערות שגרתיות פשוטות. היא חברותית, יש לה קשר עין טוב והיא יכולה להצביע על הצרכים שלה. היא יכולה להשתמש בכפית ובמזלג, בעוד היא תלויה [באחרים] לטובת כל פעילויות היומיום. יש לה ספסטיות, במיוחד בגפיים התחתונות, מה שנראה כמחמיר בהדרגה, עם הגיל. לא היו לה שום פרכוסים. בעת הבדיקה נמצאה המטופלת כסובלת ממיקרוצפליה (היקף הראש: 46 סנטימטר בגיל 7, <תאחוז שני).
היא לא הפגינה שום מאפיינים דיסמורפיים בגולגולת ובפנים. היו לה כפות ידיים וכפות רגליים קטנות וקרות. היה לה ריור מובהק. הייתה לה ספסטיות בארבע הגפיים, קשה יותר בגפיים התחתונות, לצד כוויצות בקרסוליים. הרפלקסים חדים בהימצא קלונוס בקרסוליים ותגובות ממושכות בכפות הרגליים. דימות התהודה המגנטית של הראש (MRI) בגיל 2.5 שיקף קליפת מוח דקה ואנומלית בלתי ספציפיות של החומר הלבן ברצפי ” Fluid-Attenuated Inversion Recovery” (FLAIR)/T2 בחומר הלבן העמוק והתת-קליפתי (תרשים 2S, a-c). MRI בגיל 6.5 הראה שיפור קל באנומליות של החומר הלבן (תרשים 2S, D-F). מערך כרומוזומים, חקירות מטבוליזם, מחקרים אודות התנהלות העצבים ואודות אלקטרומיוגרמה היו נורמליים.
מטופל 2
מטופל 2 (II.12) הוא אחיה בן הארבע של מטופלת 1. הוא יוצג בתמונה קלינית דומה. הוא נולד לאחר היריון ללא סיבוכים ולאחר לידה ללא סיבוכים. היו לו שלושה פרכוסים בלוויית חום גבוה, אשר נמשכו בין 5 לבין 10 דקות במשך שנת החיים הראשונה. לא היו לו שום פרכוסים בלא חום. יש לו עיכוב התפתחותי כללי. הוא החל לזחול בגיל שנתיים. בגיל 2.5 הוא יכול היה להתרומם לעמידה, אולם עדיין לא שוטט להנאתו. הוא הצליח ללפות מלקחיים בגיל שנתיים. הוא לא יכול היה להשתמש בכפית.
לא היו לו מילים. בעת הבדיקה נמצא כסובל ממיקרוצפליה (היקף הראש: 45 סנטימטר בגיל 2.5, <תאחוז שני). הוא לא הפגין שום מאפיינים דיסמורפיים. הבדיקה הנוירולוגית שלו שיקפה ספסטיות קלה בארבע הגפיים, בהתקיים רפלקסים חדים ותגובות ממושכות בכפות הרגליים. MRI מוחי בגיל 10 חודשים שיקף קליפת מוח דקה ועיכוב קל ב[העברת] המיאלין. מערך כרומוזומים ומטבוליזם היו נורמליים. אלקטרואנצפלוגרמה בגיל שנתיים לא הראתה פעילויות אפילפטית, כי אם רקע אנומלי בהיעדר שיפוע מלפנים ומאחור.
דיווח על אקסונים
DNA גנומי גובש על סמך מדגמי דם של שני האחים הפגועים (II.8 ו- II.12), היה לכוד באקסונים, וסודר ברצף באוניברסיטת מקגיל וב-” Genome Quebec Innovation Center” (מונטריאול, קנדה) תוך שימוש בערכה ללכידת אקסונים “SureSelect-V5” (אגילנט, סנטה קלרה, CA) וב-Illumina HiSeq2000 (סן דייגו, CA, ארצות הברית, 100 זוגות בסיסיים, שלושה בצורת אקסונים/בודדים). בוצעו עיבוד הנתונים, מתאר (תוך שימוש באלגוריתם של Burrows–Wheeler, BWA-MEM) וציון משתנים, לפי היישומים הכי טובים של ערכת ה- Broad Institute Genome Analysis Tool Kit ((GATKv4, קיימברידג’, מסצ’וסטס, ארצות הברית) (http://www.broadinstitute.org/gatk/guide/topic?name=best-practices),
והוסברו משתנים תוך שימוש ב- ANNOVAR (http://www.openbioinformatics.org/annovar/).
המספר הכולל של הקריאות הייחודיות, אשר עלו מכל מערך אקסונים עמד על 143,612,003 (II.8) ועל 140,086,383 (II.12), אשר 99% מתוכו מופו לאזור היעד (51 Mb). הסיקור הממוצע של בסיסי היעד עמד על 156x (II.8) ועל 149x (II.12), כאשר כוסו 99% מבסיסי היעד ≥10x. התמקדנו במשתנים, המשפיעים על תחום האקסונים והמחברים אזורים. רק באלה, שלהם גנוטיפ איכותי ≥20, אשר כוסו ב- ≥10x ואשר נתמכו על-ידי ארבעה משתנים לפחות, הקולטים את הרכב [הגנטיקה] ≥20% מסך כל המשתנים בכל מצב, אשר הובאו בחשבון. הדבר גרם לממוצע של 24,357 משתנים (24,459 של II.8 ו-24,255 של II.12), כולל 11,612 נרדפים, 10,840 הקשורים להחלפת חומצות אמינו, 1,297 באזורי חיבור, 292 הוספות/מחיקות מסודרות, 197 שינויים בדמות הוספות/בדמות מחיקות, 87 משתנים, המפסיקים את התועלת, ו-32 משתנים, המפסיקים את הרווח.
מתוכם היו 20,045 משתנים משותפים לשני המטופלים. רשימה זו של משתנים משותפים פחתה לאחר מכן ל-252 משתנים נדירים בעזרת סינון: (i) כל המשתנים הנרדפים, אשר אינם צפויים להשפיע על חיבור, (ii) משתנים, המיוצגים ב-≥1%, באקסונים שלנו (n=700) מפרויקטים, אשר אינם קשורים ל-ID. ו-(iii) משתנים, המיוצגים בשכיחות אלל מינורי ב-(MAF)≥0.006, ב- Genomes Project(1KG; http://browser.1000genomes.org/index.html), או ב- National Heart, Lung, and Blood Institute Exome Sequenc-
ing Project (Exome Variant Server; EVS: http://evs.gs.washington.edu/EVS/).
תוצאות ודיון
חקרנו שני אחים בעלי ID חמור ומיקרוצפליה, אשר נולדו למשפחה קרובה יהודית אשכנזית. במשפחה זו אף היו 11 ילדים אחרים רגילים. לאור הקרבה מדרגה ראשונה של ההורים ולאור ההיסטוריה המשפחתית הנחנו, כי מוטציה הומוזיגוטית הייתה, כנראה, אחראית למצב הזה. בין 252 המשתנים הנדירים, המשותפים לשני האחים הפגועים, מצאנו ארבעה משתנים הומוזיגוטיים ולא יותר: (i) c.2758+3A>G (NM_015275.2) ב-KIAA1033 (OMIM615748) (ii) c.622G>C (p.E208Q)(NM_005475.2) ב- SH2B3 (OMIM605093) (iii) c.290G>A(p.S97N) (NM_032307.3) ב-C9orf64 (OMIM611342) ו-(iv) c.766G>A (p.E256K) (NM_003038.4; rs201278558) ב- SLC1A4 (OMIM600229).
קבענו את הגנוטיפ של ארבעת משתנים הומוזיגוטיים אלה תוך שימוש ברצף של Sanger בקרב כל בני המשפחה, ורק המשתנה ב- SLC1A4 נמצא הטרוזיגוטי בקרב ההורים והומוזיגוטי בקרב שני המטופלים, ואילו לא בקרב אף אחד מ-11 האחים הרגילים שלהם (תרשים 3S). יש לשים לב, כי אף על-פי ש- KIAA1033 (OMIM615748) נחשב לקנדידט לגן נסגני של ID, לגן אשר קשור לכרומוזומים, שאינם כרומוזומי מין. משתנה ה-c.2758+3A>G, אשר זוהה בזאת, אינו פתוגני בבירור, מפני שהוא נמצא אף כהומוזיגוטי בקרב האב הרגיל ובקרב שניים מהאחים הרגילים (בני 7 ו-23). למעלה מכך, מצב ה-+3 של מקום איסוף התרומות בדרך כלל נסבל בנוקלאוטידים מסוג A, או G. למעשה, חיזוי אין סיליקו [באמצעות טכניקה להדמיה, המתבצעת במחשב] על-ידי ה-Human Splicing Finder, אשר הורה, על כך שמשתנה זה אינו פוגע בחיבור (http://www.umd.be/HSF3/). יחס הסבירות למען קישור בין המשתנה הקנדידט ב- SLC1A4 לבין פנוטיפ המחלה עומד על 378.83, מה שגורם לציון LOD של 2.58. משתנה ה- SLC1A4מוצג בתחום גדול של הומוזיגוטיות (∼24 Mb), המשותף לשני האחים הפגועים, כפי שנקבע על-פי המשתנה.
היה ניבוי, כי ה-p.E256K, הקשור להחלפת חומצות אמינו ב-SLC1A4, מזיק תוך שימוש, הן ב- SIFT (http://provean.jcvi.org/genome_submit_2.php) והן ב- PolyPhen-2 (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/). הדבר משפיע על חומצת אמינו, אשר האבולוציה משמרת מדג הזברה (Fig. S1, B) ואשר מתאים לאמצע [מולקולת] החלבון בהצטלבות של הלולאה התוך-תאית השנייה שלה לבין כל שטח הממברנה מספר 5 (תרשים 1S, c). נדיר מאד באוכלוסייה הכללית, כשמדווח על MAF הטרוזיגוטי של 0.000077 ב- EVS (1/13,005 אללים) ועל 0.00017 ב- ExAC((http://exac.broadinstitute.org/; 21/120,744 אללים). על משתנה זה לא דווח במצב הומוזיגוטי בשום בסיס נתונים ציבורי (dbSNP, 1KG, EVS and ExAC). קבענו את הגנוטיפ של משתנה זה תוך שימוש בניסוי TaqMan®, שתוכנן כנהוג (ברינגטון, ON, קנדה) ל- rs201278558, בקרב 450 פרטים יהודים אשכנזים, שאינם קרובי משפחה, כולל 271 חברי קבוצת ביקורת מבוגרים, אשר גויסו בעבר למחקר על מחלת הפרקינסון (1) ו- 179 חברי קבוצת ביקורת צעירים, אשר נבחרו באופן אקראי.
מצאנו זאת במצב ההטרוזיגוטי בקרב 5/450 פרטים, שנבדקו (MAF: 0.0056), מה שמצביע, על כך שהדבר שכיח יותר פי 72–32 בקרב האוכלוסייה היהודית האשכנזית, בהשוואה לאוכלוסייה הכללית (0.0056/0.00017–0.000077), אף שהוא נדיר יחסית. זו יכולה להיות מוטציה מכוננת בקרב האוכלוסייה היהודית האשכנזית, מאידך גיסא תידרש עבודה נוספת לווידוא אפשרות זו.
גם וידאנו, האם היו משתנים הטרוזיגוטיים מורכבים פוטנציאליים נדירים, אשר היו משותפים לשני האחים, אשר יכלו להסביר את הפנוטיפ שלהם. לא היו משתנים הטרוזיגוטיים מורכבים פוטנציאליים בגנים ידועים של ID. מצאנו שני גנים גרידא בעלי משתנים הטרוזיגוטיים,
הקשורים להחלפת חומצות אמינו: MASP2 (rs61735594:NM_006610.3:c.1213G>A
[p.V405M]/c.383C>T [p.T128M]) and RAD54B (NM_012415.3:c.2695A>G [p.I899V]/c.2498G>A [p.G833E]).
להוציא p.V405M ב-MASP2, כל אלה משתנים, המנובאים כבלתי מזיקים על-ידי SIFT ועל-ידי PolyPhen-2. אף אחד מהם לא השפיע בעבר על התפתחות המוח, או על תפקודו.
אנחנו מסיקים, כי לא סביר, כי משתנים הטרוזיגוטיים אלו יהיו פתוגניים. SLC1A4 (ASCT1) מקודד מוביל תלוי סודיום לחומצות אמינו ניטרליות דוגמת אלנין, דוגמת סרין, דוגמת ציסטאין ודוגמת תראונין. סרין-L נחוץ להישרדות הנוירונים ולהבדלה ביניהם, משום שהוא משמש מוביל בביו-סינתזה של מגוון חלבונים, של מולקולות ליפידים של ממברנות ושל המעבירים הבין עצביים, גליצין וסרין-D (3, 2). במוח עובר סרין-L סינתזה מהותית באסטרוציטים ולא בנוירונים (5, 4). לפיכך אף כי הוא נחשב לחומצת אמינו, שאינה נחוצה, הלכה למעשה, הוא מהווה חומצת אמינו נחוצה לנוירונים (7–5). במוח מובחנת הבעת ה- ASCT1 בנוירונים ובתאי גלייה רדיאליים בהתפתחות המוקדמת, מאידך בשלב מאוחר יותר בחיים הוא נעשה מוגבל לאסטרוציטים (8). הוצע, כי ASCT1 מתווך בין ספיגת סרין-L בנוירונים, לכל הפחות במשך ההתפתחות המוקדמת, לבין שחרור glia-borne l-serine לתאים שכנים במהלך החיים (9, 8, 6, 5).
הפרעות בביו-סינתזה של ה-סרין-L גורמות לעיכוב התפתחותי חמור, ל-ID, למיקרוצפליה, לפרכוסים ולדיסמיאלינציה (10), פנוטיפ דומה לזה של המטופלים, המתוארים בזאת. אנו מציעים, כי שיבוש ב- SLC1A4מפריע להתפתחות המוח ולתפקוד על-ידי הערמת קשיים על שחרור ה-סרין-L על-ידי האסטרוציטים ו/או על ספיגתו בנוירונים. חשוב, שבפגמים בביו-סינתזה של ה-סרין-L ניתן לטפל על-ידי הוספת סרין-L. הדבר מחזק את האפשרות, כי הוספת סרין-L אף תשפר את המומים הנוירולוגיים, הקשורים למוטציות ב-SLC1A4.
לסיכום, אנו מוכיחים, כי שיבוש ב- SLC1A4 גורם הפרעה, אשר לא זוהתה קודם לכן, במטבוליזם של הסרין. איתור משפחות נוספות, אשר נושאות את המוטציות ב-SLC1A4, יידרש לאישור תפקידו של גן זה ב-ID.