מוטציית SLC1A4 חדשה (p.Y191*) גורמת טטרהפלגיה, כפיס מוח דק ומיקרוצפליה פרוגרסיבית (SPATCCM) לצד הפרעת פרכוסים
הנאדי א. עבד אלרחמן, 1MBBS, MSc1, עיישה אלשמסי, MBBS, MRCPCH2, אן ג’ון, , MSc1, דוקטור באסם ר. עלי1,3, ליהאד אלע’זאלי, FRCP4

הקדמה
טטרהפלגיה ספסטית, כפיס מוח דק ומיקרוצפליה פרוגרסיבית מהווים הפרעה נסגנית נוירו-התפתחותית נדירה עד מאד, אשר קשורה לכרומוזומים, שאינם כרומוזומי מין, ואשר תוארה לאחרונה. פגיעה זו תוארה לראשונה ב-2015 בקרב משפחות אחדות ממוצא יהודי אשכנזי בעלות מוטציה מכוננת ב- SLC1A4 (p.E256K)כגורם הגנטי מבסיסי. גן ה- SLC1A4 מקודד למען מוביל חומצות האמינו, ASCT1, הנחוץ להעברת סרין מהתאים אל הנוירונים. הערכנו מבחינה רפואית שני אחים פקיסטניים, הסובלים מעיכוב התפתחותי כללי חמור, ממיקרוצפליה פרוגרסיבית ומהפרעת פרכוסים.

ביצענו סידור אקסונים ברצף, סידור ברצף על-פי Sanger וניתוח, המתבצע תוך בידול, כדי לזהות את הגורם הגנטי לפנוטיפ, הנלווה לניתוח אין סיליקו, להערכת הפתוגניות של מוטציה מזוהה. זיהינו משתנה הומוזיגוטי חדש (c.573T>G) בקרב שני המטופלים. נחזה, כי המוטציה יוצרת מוטציה חסרת משמעות (p.Y191*) בחלבון ה-ASCT1. פה אנו מדווחים על המוטציה החמישית, הגורמת לפגיעה בגן ה- SLC1A4וסוקרים את כל המקרים, אשר דווח עליהם בעבר.

מילות מפתח: עיכוב התפתחותי, אנצפלופתיה אפילפטית, ספאזם בקרב תינוקות, סידור ברצף לדור הבא, ספסטיות

נתקבל ב-24 בדצמבר 2018. הותר לפרסום ב-19 בינואר 2019.

טטרהפלגיה ספסטית, כפיס מוח דק ומיקרוצפליה פרוגרסיבית מהווים הפרעה נסגנית נוירו-התפתחותית נדירה עד מאד, אשר קשורה לכרומוזומים, שאינם כרומוזומי מין, ואשר תוארה לאחרונה (MIM: 616657). היא מתאפיינת בעיכוב התפתחותי כללי חמור בשלב מוקדם לצד מיקרוצפליה פרוגרסיבית. נראה, כי היא נגרמת על-ידי מוטציות הומוזיגוטיות, הגורמות לאובדן תפקוד בגן ה-SLC1A4, המקודד את מוביל חומצות האמינו הניטרליות (ASCT1).
רוב המטופלים, אשר תוארו עד כה, לא היו מסוגלים ללכת באופן עצמאי, או לדבר באופן עצמאי1-4. הפנוטיפ עצמו תואר לראשונה על-ידי Damseh ועל-ידי עמיתיו ב-2015 בקרב 11 מטופלים ממשפחות, אשר אינן קשורות זו לזו, צאצאיות של אוכלוסייה יהודית אשכנזית. כל המטופלים הוצגו כבעלי מגבלות תורשתיות אינטלקטואליות חמורות, אשר להן גורם גנטי בלתי ידוע. תוך שימוש ברצף של הגנום האנושי כולו היו הם מסוגלים לגלות מוטציה מכוננת ב- ASCT1 (p.E256K)בקרב 10 מתוך 11 המטופלים ומוטציות R457W ו- p.L314Hfs*42 בקרב המטופל ה-11.

ניתוח, המתבצע תוך בידול בקרב משפחות אלו, אישר את התורשה הנסגנית, אשר קשורה לכרומוזומים, שאינם כרומוזומי מין. המוטציה המכוננת נמצאה מיוצגת כהלכה באוכלוסייה היהודית האשכנזית, בשיעור נשאים של 0.7%1. מוטציה זו אף נתגלתה בקרב 2 משפחות, אשר תוארו על-ידי Heimer ושות’2 ועל-ידי Srour ושות’3. שתי המשפחות היו ממוצא יהודי אשכנזי והמטופלים יוצגו בעזרת פנוטיפ דומה2,3. יותר לאחרונה דיווחו Conroy ועמיתיו4 על מוטציית SLC1A4 חדשה בקרב ילד אירי, המייצגת ספסטיות בקרב תינוקות, שלילת האפשרות, כי SPACCM מהווה פגיעה ספציפית באוכלוסייה מסוימת. פה אנחנו מתארים עוד מוטציה חדשה חסרת משמעות בקרב משפחה פקיסטנית, אשר בה שני אחים, המיוצגים על-ידי פנוטיפ דומה.

1 המחלקה לגנטיקה ולגנומיה, הקולג’ למדעי הרפואה והבריאות, אוניברסיטת איחוד האמירויות, אלעין, איחוד האמירויות
2 המחלקה לרפואת ילדים, בית החולים “טוואם”, אלעין, איחוד האמירויות
3 מרכז זיד למדעי הבריאות, אוניברסיטת איחוד האמירויות, אלעין, איחוד האמירויות
4 המחלקה לרפואת ילדים, הקולג’ למדעי הרפואה והבריאות, אוניברסיטת איחוד האמירויות, אלעין, איחוד האמירויות

ליצירת קשר עם הכותבת:
ליהאד אלע’זאלי, המחלקה לרפואת ילדים, הקולג’ למדעי הרפואה והבריאות, אוניברסיטת איחוד האמירויות, ת. ד. 17666, אלעין, איחוד האמירויות
אימייל: l.algazali@uaeu.ac.ae

מטופלים ושיטות
הסכמת מטופלים – אישור אתי
מחקר זה אושר על-ידי ועדת האתיקה של “Al-Ain Medical Human Research”, בהתאם לתקנות הלאומיות (פרוטוקול מספר 10/09). ההורים סיפקו הסכמה מדעת כתובה לפני המחקר ולפני הפרסום. אימתנו בני משפחה פקיסטנית אחת, אשר ביניהם קיימת קרבת דם ואשר בה 2 ילדים פגועים, אשר יוצגו שניהם בשלב מוקדם כסובלים ממיקרוצפליה פרוגרסיבית, מעיכוב התפתחותי כללי ומספסטיות. לא דווח על שום היסטוריה משפחתית ראויה לציון. הושגו נתונים קליניים באמצעות היסטוריה מקיפה ובאמצעות בדיקה רפואית. הפרמטרים של הצמיחה מתוקננים תוך שימוש בבסיס הנתונים של ה-” National Center for Health Services/World”/של ארגון הבריאות העולמי בנוגע לצמיחת הילדים. דגימות דם חלקיות נאספו מכל בני המשפחה בשפופרות EDTA.

גילוי DNA וסידור ברצף של הגנום האנושי
ה- DNAשל האחים הפגועים ושל ההורים שלהם הוצא מתאי דם צידיים תוך שימוש בערכה “Flexigene” לגילוי DNA (Qiagen Gmbh, גרמניה), לפי פרוטוקול היצרן. סידור ברצף של הגנום האנושי כולו בוצע על-ידי מעבדת CENTOGENE AG ברוסטוק, גרמניה (www.centogene.com). המדגם עו∙בד בפלטפורמת “Ion Proton” (Life Technologies,Renfrew, אנגליה). בערך 33 Mb של אקסונים לקידוד שונו, כמתואר ברצפי הקידוד של Consensus. מאגרי בסיסים גדולים למדי היו בשימוש כדי לבנות את ספריית האמפליקון תוך שימוש בהגדלת שרשרת הפולימרים, המבוססת על תגובות. על-פי תכלית הבסיסית ועל-פי הסינון העיקרי של קריאות באיכות ירודה, הוחדר אמצעי ביו-אינפורמטיקה סטנדרטי לפירוש משתנים, שנתגלו, ולסינון ממצאי שווא אפשריים. בנוסף, בוצעה בדיקת מולקולות באחות הפגועה ובהורים שלהם בעזרת סידור ה- DNA ברצף על-פי Sanger.

ניתוח משתנים אין סיליקו
המשתנים הושוו לחברי קבוצת הביקורת ב- dbSNP build 147(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/), בפרויקט אלף הגנומים (http://www.1000genomes.org/) . בסיס נתוני שכיחות הגנוטיפ בקרב ערבים (http://galaxc.sengenics.com) ובסיס נתוני מאגד הצטברות האקסונים (http://exac.broadinstitute.org). ההשפעה התפקודית של המשתנים, אשר אותרו, הוערכה באמצעות הביו-תוכנה האינטראקטיבית “Alamut visual v.2.9.0”, המשמשת הרבה אמצעים לחיזוי פתוגניות אין סיליקו, כדוגם מוטציות “Sorting Intolerant FromTolerant” ו-“Align GVGD”. שימור האלל, המהווה את מקור המשתנים, הוערך במערך הרצף מרובה ה- UCSCל-100 בעלי חוליות5. שטחי החלבון, שנפגעו, נבדקו תוך שימוש במבנה החלבון המדובר ב-6UniProt. בניית מודל של חלבונים מהסוג הפראי ושל חלבונים היפותטיים, שעברו מוטציה נעשתה תוך שימוש “במודל השוויצרי” /http://www.swissmodel.expasy.org))7.

תוצאות ודיון
אימתנו [נתונים] של בני משפחה פקיסטנית אחת, אשר ביניהם קיימת קרבת דם, אשר לוקטו במרפאת הגנטיקה של בית החולים “טוואם”, של 2 ילדים פגועים, אשר יוצגו שניהם בשלב מוקדם כסובלים ממיקרוצפליה פרוגרסיבית, מעיכוב התפתחותי כללי ומספסטיות (תרשים 1A). לא דווח על שום היסטוריה אחרת משפחתית ראויה לציון. הילד הראשון כיום בן 7 ונולד בלידה וגינלית רגילה לאחר הריון, שבו הייתה היסטוריה של סיבוכים, של מיעוט מי שפיר ושל תנועות עובריות פחותות. מסת הגוף שלו בלידה הייתה 2,800 גרם והיקף הראש היה 31.1 סנטימטרים (סטיית תקן של 2.4 (SD)). תקופת הינקות המוקדמת חלפה כרגיל ובגיל חודש שמו ההורים לב, לכך שהוא פיתח רגזנות מוגברת ובכי מוגזם. בגיל 6 חודשים הוא פיתח פרכוסים, אשר השפיעו על מתח השרירים בתנועות עיניים בלתי רצוניות, אשר נמשכו 2-3 דקות פעמיים-שלוש ביום. בתחילה הוא טופל ב- אוקסקארבאזפין [תרופה אנטי- אפילפטית], אחר נוספה חומצת סודיום ולפרואית והוא הגיב תגובה הגיונית.

תדירות הפרכוסים ירדה לפעם בחודשיים-שלושה. תנועות ידיים חוזרות אנומליות אובחנו בגיל שנה וחצי. הן כללו משיכה בשערות, הכאה עצמית ותנועת רחיצת ידיים. הכל השתפר עם הזמן. היה לו גם ריור מתמשך, בתגובה ל-1.5 מיליגרם סקופולמין. עדיין היו קשיי לעיסה ובליעה והיסטוריה של דלקת ריאות תשניקית. בדיקה בגיל 6 הראתה היקף ראש של 35.5 סנטימטרים (סטיית תקן של (2.7-) בעל מאפיינים דיסמורפיים אחדים, כולל היפרטלוריזם, כולל גשר אף שקוע, כולל סינופריס וכולל אוזניים בולטות. הסכמה לפרסום תמונות פחתה. יש לו ספסטיות בכל הגפיים ורפלקסים חדים. היה לו קלונוס בגפיים התחתונות ורפלקס Babinski חיובי. הוא עוכב בכל היבטי ההתפתחות.

הוא היה מסוגל לחייך עקב גירויים, הייתה לו שליטה מסוימת בראש והוא לא היה מסוגל להתהפך, לשבת, או לעמוד. הוא משמיע קולות חלושים וממלמל, אך אינו הוגה ולו מילה
אחת ואין לו שליטה בשלפוחית השתן. בדיקות השמיעה והראייה היו תקינות. אלקטרואנצפלוגרפיה (EEG) הראתה חוסר תפקוד המיספרי דו צדדי ואסימטריה לצד הפרשות פוקליות אפילפטיות עצמאיות בהמיספרה השמאלית. דימות תהודה מגנטית (MRI) של המוח שיקף דלדול מוחי דו צדדי בינוני עד חמור, שבמסגרתו קיים דלדול ראוי לציון של כפיס המוח (תרשים 1B). כמה בדיקות היו תקינות, כולל שרשרת ארוכה מאד של חומצות שומן ושל חומצה פיטנית, של קרניטין ושל אציל-קרניטין, של אמוניה ושל לקטאט, כולל מצב חומצות האמינו, כולל חומצת שתן אורגנית, כולל “transferrin isoelectric focusing” [סוג של מבחן מיסוך], כולל מערך מיסוך וכולל מיסוך פנל גנטי של מיקרוצפליה.
האחות הקטנה שלו, בת שלוש, נולדה בלידה וגינלית רגילה בלי סיבוכים לפניה ואחריה. היקף הראש היה 31 סנטימטרים (ציון Z= סטיית תקן של 2.4-) בלידה. היא נבדקה על-ידי נוירולוג בגיל 7 חודשים בשל תנועות אנומליות תדירות, החוזרות על עצמן עד 10 פעמים ביום בצורת תנועות קלוניות של הגפיים העליונות והתחתונות שלה, הבצורת סיבוב הגוף שלה ימינה, המלווה בשינה למשך שניות. אלקטרואנצפלוגרפיה הראתה האטה פוקלית תמידית בצד ימין עד האזור הפגוע קל באופן זמני, המרומז בגין אנומליה מבנית בסיסית. היא התחילה ליטול טרילפטל. בגיל שנה עלתה תדירות הפרכוסים וכללה פרכוסים פוקליים. ה- EEG שלה עולה מאנצפלופתיה אפילפטית. היא החלה לסבול מספאזם פעמיים-שלוש ביום בגיל שלוש. אלקטרואנצפלוגרפיה לא הצביעה על היפסריתמיה, היא התחילה ליטול ויגברטין, והתגובה הייתה הגיונית.

[תרשים 1A]

תרשים 1A- אילן היוחסין של האחים הפגועים. B, ממצאי דימות התהודה המגנטית (MRI) של הבן הפגוע בגיל 4. שימו לב להיעדר כפיס המוח, להיפומלינציה של המיספרות המוח ולדלדול המוחי. C, תעתיק ה- SLC1A4קובע את מיקום המוטציה. D, מבנה החלבון הטופולוגי ומיקום הקודון, אשר הפסיק לפעול מוקדם.E, החלבון, אשר היה אמור לעבור מוטציה, מבנה D3, טופל על-ידי המודל השוויצרי/ExPAS אמצעי החיזוי של ההמיספרה השמאלית, בהשוואה לחלבון מהסוג הפראי, אשר טופל (בהמיספרה הימנית).

טבלה 1- המצב הרפואי של כל המטופלים, אשר בקרבם דווח על מוטציות ה-.SLC1A4
[טבלה 1]

יש לה עיכוב התפתחותי כללי, ובגיל 3 היא שולטת בראש שלה ואינה מסוגלת להתהפך, או לשבת. היא ממלמלת ללא מילים שלמות. היא אינה מקבעת את מבטה, עוקבת בעיניה, או מחייכת. בדיקה נוירולוגית שיקפה את הנוקשות בכל הגפיים, אף בעת תנועה סבילה, בלוויית רפלקסים חדים ובלוויית רפלקס Babinski חיובי. נמצא קלונוס בגפיים התחתונות.

ביצענו סידור אקסונים ברצף במקרה המדד ובמשתנה הומוזיגוטי בגן ה- SLC1A4 NM_003038.4:: g.65231089T>G, p.(Tyr191) ונתגלה c.573T>G, Chr2(GRCh37). המשתנה c.573T>G מהווה משתנה חסר משמעות, המוביל להחלפת הטירוזין במצב 191 בקודון, אשר הופיע מוקדם (תרשים C1 ו-D). משתנה זה, הממוקם גם באקסון 3, התגלה גם כן על-ידי סידור ברצף על-פי Sanger במצבה ההומוזיגוטי של האחות הפגועה, של שני ההורים ושל אח אחד רגיל צעיר יותר. על כך לא דווח בבסיסי הנתונים של מאגד הצטברות האקסונים, של אלף הגנומים, של אנסמבל, או של ה-dbSNP. בחיזוי אין סיליקו דווח על מוטציה זו בפתוגניות בלתי ידועה בתור “דרגה 3” בדיווח החזותי של Alamut.

בדוגם המוטציות (http://www.mutationtastr.org) נמצא, כי הפגיעה השפיעה על יציבות “השליח” RNA והיא “תורגמה” איכשהו. החלבון, אשר עבר מוטציה, לא יתפקד, מפני ש-6 מתוך 9 התחומים הסליליים, המכסים את כל ממברנת החלבון ASCT1, קודדו על-ידי הרצף בשביל לעבור מוטציה, לכן יאבדו. בנוסף, התחום הטופולוגי החוץ תאי (AA140-AA216) אבד בחלקו, זאת מלבד אובדן התחומים, אשר בהם מוגבלים ה- Na+, ה- Na1 וה- Na3ב- AA380וב- AA467 (תרשים 1D ו-E). פרט לכך 6 מתוך 9 התחומים הסליליים, המכסים את כל ממברנת החלבון, יאבדו אף הם. חוץ מזה, 5 מתוך 6 התחומים, שעברו שינוי לאחר “התרגום” (גליקוזילציה ב- Asn201 וב- Asn206ופוספורילציה בSer507-, ב- Ser527 וב- Ser530), יאבדו.

ASCT1 מהווה מוביל חומצת אמינו ניטרלי, התלוי ב-Na, לסרין, לאלנין, לציסטאין ולתראונין, אשר קודד על-ידי משפחת הנשאים 1 בעזרת תמיסה, 4 גנים. (SLC1A4)8. סרין-L מהווה חומצת אמינו, שאינה נחוצה, שיש אפשרות להשיג מדיאטה, מגליצין ומהפחתת חלבונים. הוא יכול אף לעבור ביו-סינתזה חוזרת בעזרת 3-phosphoglycerate, המגשר לאורך הדרך הגליקולית, לשמש לסינתזה של חלבונים, של נוקלאוטידים, של הם [תרכובות אורגנו-מתכתיות] ושל חומצות אמינו אחרות8. למרות היות חומצת אמינו, שאינה נחוצה, הסינתזה החוזרת, אשר עברה במוח, נחוצה בעקבות תפקידיה הקריטיים, הנוגעים לנוירונים, ובעקבות החדירו∙ת הדלה שלה למחסום, הקיים בדם ובמוח9. סרין-L חשוב במיוחד במוח, משום שהוא מחולל את הסינתזה של ציסטאין-L. של פוספטידיל-L, של סרין-L, של ספינגוליפידים ושל חומרים, הגורמים אפנון עצבי, דוגמת סרין-D, המפעיל את קולטן הגלוקומט הסלקטיבי של N-methyl-D-aspartate10.

הסינתזה של סרין-L במוח מוגדרת כאסטרוציטים ומועברת אל הנוירונים על-ידי מוביל חומצות האמינו ממשפחת 1 (ASCT1). לפיכך הבעת ה- ASCT1בנוירונים ותפקודו בהם נחוצים להתפתחות נוירונים מוקדמת ולתפקוד מוקדם שלהם. טיפולי הוספת סרין נוסו לטובת כמה מומים בביו-סינתזה של הסרין11. אבל יתרון השימוש בסרין מוטל בספק, בהינתן, שהמומים הנוירולוגיים שלו חלו בשלב מוקדם בחיים ברחם. מן הראוי ללמוד בעתיד, האם מתן מינון גבוה של סרין, גבוה דיו בשביל לעבור את המחסום, הקיים בדם ובמוח, לשם ספיגת הנוירונים, יהיה בטוח ויוכל להגביל את התקדמות הפגיעה. דווח על שלוש מוטציות ב- ,ASCT1הגורמות לאובדן תפקוד (p.E256K,p.L314Hfs42, and p.R457 W) , בקרב משפחות מהאוכלוסייה היהודית האשכנזית כעל גורמות טטרהפלגיה ספסטית, כפיס מוח דק ומיקרוצפליה פרוגרסיבית. תינוקות מייצגים בשלב מוקדם טטרהפלגיה ספסטית, מיקרוצפליה ועיכוב התפתחותי כללי1-3. MRIשל המוח בקרב הילדים הפגועים מראה כפיס מוח דק, דמיאלינציה פרוגרסיבית ואנומליות בחומר הלבן. צוין, כי שיעור הנשאים של מוטציות ה- SLC1A4בקרב האוכלוסייה היהודית האשכנזית עומד על 0.7% והומלץ להוסיפו לפנל המיסוך של הנשאים בקהילה זו1. Conroy ועמיתיו דיווחו על המטופל הראשון, הסובל מטטרהפלגיה ספסטית, מכפיס מוח דק וממיקרוצפליה פרוגרסיבית, ילד אירי, הסובל מספאזם מינקות, ממשפחה, הנושאת את המוטציה חסרת המשמעות (p.W453X). סקירת הייצוג הרפואי של כל המטופלים, אשר תוארו קודם לכן מסוכם בטבלה 1.

כמומחש בטבלה 1, מעבר לדיווח על המאפיינים הדיסמורפיים של המטופלים, הסובלים מ- SPACCMומפרכוסים ספסטיים קשים, לצד עוויות קלוניות, הנובעות ממתח השרירים, לצד פלבול בעיניים ובלוויית אובדן ההכרה מיקום המוטציה חסרת המשמעות, אשר עליה דווח פה, טמון בשכפול ה- SLC1A4לכל המוטציות הפתוגניות, אשר דווח עליהן לפני כן, וחוץ מהחפיפה בפנוטיפים, הסקנו, כי זו, בעצם, מוטציה, הגורמת לפגיעה. חשוב לשים לב, לכך שמפאת קרבת הדם הקרובה בהיסטוריה המשפחתית, יתכן דו קיום של משתנים נסגניים למכביר. ניסינו להשתמש במדגם הזמין של המטופל (דם צידי) כדי לבחון את שחיקת ההיפותזה המתווכת חסרת המשמעות, אולם לא גילו את השכפול בקרב המטופלים ואף לא DNA משלים לביקורת. יהיה מעניין לבחון את ההשלכה התפקודית של מוטציה זו על גורל השכפול.

בהתבסס על הממצאים שלנו ועל תוצאות ניתוח בסיס הנתונים של מוצא האוכלוסייה של מאגד הצטברות האקסונים4, אנו מציעים, כי ייחקר מחסור ב- ,ASCT1מבלי להתייחס לאתניות של אף ילד, לגבי אנצפלופתיה אפילפטית בלתי מוסברת, אשר התפרצה בשלב מוקדם, או לגבי עיכוב התפתחותי כללי.