מוטציות ב-SLC1A4, מוביל קידוד הסרין [סוג של חומצת אמינו] במוח, הקשורות לעיכוב התפתחותי, למיקרוצפליה ולהיפומלינציה
נדירה דמש1, אלכסנדר סימונין2, חיים ג’לס3, יוסף א. פיקוררו4, אברהם שאג5, מגאן ט. צ’ו 4,6, ברק יעקוב5, ג’ולי ניידיץ’6, מוטי אלאשהב1, ג’יין ג’ואוסולה6, שרי בייל6, איידה טלגרפי6, קייל רטרר6, ג’ון ג. פאפאס7, אלן מורן7, יהושע קפל8, קוויים אניאן יבואה4, בסאם אבו ליבדה1, מתיאס א. הדיגר2, וונדי ק. צ’אנג4,9, אורלי אלפלג5, סימון אדוורדסון5

הקדמה
רקע: סרין-L משחק תפקיד מהותי בהתפתחות הנוירונים ובתפקודם. על אף חומצת האמינו, שאינה נחוצה, חייבת להתבצע במוח סינתזה של סרין-L בשל החדירו∙ת הדלה שלו למחסום בדם ובמוח. הסינתזה שלו במוח מוגבלת לתאים כוכביים והמעבר שלו לתאי עצב מתבצע על-ידי מוביל חומצת אמינו ניטרלי, ASCT1.

שיטות ותוצאות: תוך שימוש בניתוח כלל האקסונים זיהינו את המוטציות הנסגניות, p.E256K, p.L315fs ו- p.R457W ב-SLC1A4, המקודד את הגנים בקרב מטופלים, הסובלים מעיכוב התפתחותי, ממיקרוצפליה ומהיפומלינציה. הייתה הפרעת פרכוסים משתנה. כאשר הובעה היא במערכת הטרולוגית, לא פגעו המוטציות ברמת החלבון בממברנת הפלזמה, כי אם מוגרו, או הפחיתו במידה ניכרת את העברת המוטציות, p.R457W ו-p.E256K, בהתאמה על-ידי ה-סרין-L.
למרבה העניין, הפגינה מוטציית ה-p.E256K רמת סרין-L נמוכה יותר וזיקה פחותה יותר לאלנין, אך את אותה בררנות לגבי מצע כסוג הפראי, ASCT1.

מסקנות: המחסור בפנוטיפ הקליני, ASCT1, מזכיר פגמים בביו-סינתזה של ה-סרין-L. הנתונים הבליטו, כי ASCT1 נחוץ להעברת הסרין במוח.
מוטציית ה-p.E256K ב-SLC1A4 בעלת שכיחות גבוהה יותר, של 0.7%, באוכלוסייה היהודית האשכנזית וכדאי להוסיפה לפנל המיסוך הגדול יותר בקהילה הזאת.

מבוא
סרין-L משחק תפקיד מהותי בהתפתחות הנוירונים ובתפקודם. לא זו בלבד שהוא משמש אבן בניין של החלבונים, אלא אף כפרקורסור לסינתזה של ה-L-ציסטאין, כפוספטידיל סרין, כספינגוליפידים, כנוקלאוטידים וכמאפננים העצביים, סרין-D וגליצין1,2. סרין-L מהווה חומצת אמינו, שאינה נחוצה לרקמות חוץ-עצביות, אבל הסינתזה המחודשת שלו במוח נחוצה, בגין החדירו∙ת המוגבלת שלו בגין מחסום ה-סרין-L בדם ובמוח3.
סרין-L עובר סינתזה מה-3-פוספוגליצריד המתווך הגליקוליטי בשלושה צעדים עוקבים. דרך ביו-סינתטית זו מוגבלת לאסטרוציטים4, וה-סרין-L, אשר נוצר, מועבר הלוך ושוב לתאי העצב בעזרת מוביל, שזה תפקידו, ASCT1 (מערכת העברת Na+ בלתי תלויה, המעדיפה ASC (Ala, Ser ו-Cys) 5.

בעבר דווח על פגמים בכל שלושת הצעדים האנזימטיים של הביו-סינתזה של סרין-L בקרב בני אדם, המופגנים על-ידי מגוון נרחב של תסמינים נוירולוגיים (הנסקרים במקור 6). עתה אנחנו מדווחים על פגם חדש במטבוליזם של הסרין במוח, אשר נובע ממוטציות נסגניות ב-SLC1A4 תוך קידוד מוביל ה-ASCT1.

מטופלים ושיטות
מטופלים: המטופלים היהודים האשכנזים (AJ) משמונה משפחות חלקו כולם מאפיינים קליניים דומים, של מיקרוצפליה ושל עיכוב התפתחותי מובהק (תרשים 1 וטבלה 1). כל הילדים נעו בגילאי 3-15. מתוך תשעת מדדי היקף הראש (HC) כבר נכללו ארבעה תחת התאחוז החמישי בלידה, בעוד חמישה נכללו בתאחוז העשירי עד ה-75. אף על-פי כן עד גיל 6 חודשים סבלו כל המטופלים ממיקרוצפליה. בתחילה היו כולם היפוטוניים והעיכוב במוטוריקה הגסה היווה הוכחה סביב גיל 6 חודשים, ישיבה עצמאית הושגה בגיל 9-16 חודשים והתרוממות לעמידה בגיל 20-27 חודשים, אולם חלק מהמטופלים עדיין לא עמדו בגיל 3. דווח על שלושה מטופלים, אשר הלכו בגיל 4, ואשר אחד מהם איבד את היכולת ללכת באופן עצמאי עקב ספסטיות.

ההבנה נפגעה קשות וההבעה השפתית כלל לא התקיימה. אך ורק מטופלת אחת (מטופלת 6) הייתה בעלת יכולת מילולית ופיתחה צירופי מילים קצרים אחדים כילדה מתבגרת. לא דווח על פרכוסים בקרב 5/10 מהמטופלים, ובקרב השאר נצפה טווח, מפרכוס יחיד בעת קדחו מחום ועד אפילפסיה סוררת. ה- EEGהיה תקין, או שגילה עליות חדות, אשר מעוררות התקפים, או היפסריתמיה. השמיעה והראייה נפגעו באופן מינימלי ובצורות שונות.
לאף אחד מהילדים לא היו מאפיינים דיסמורפיים ולא הייתה הוכחה למעורבות, שאינה נוירולוגית, למחלה סיסטמית, או למומים מולדים. הגובה ומסת הגוף בדרך כלל לא נפגעו. MRI של המוח קבע קליפת מוח דקה בקרב 4/10 מהמטופלים, מיאלין מופחת בקרב 5/10 מהמטופלים ודלדול מוחי בקרב 3/10 מהמטופלים (תרשים 2 F-A). הערכת הגנטיקה והמטבוליזם הקודמות לא השתקפו בכל המקרים. לכל המטופלים היו חומצות אמינו נסיוביות בכמות תקינה, ולמטופל 2 היו חומצות אמינו של נוזל המוח וחוט השדרה (CSF) בכמות תקינה (אלנין, 23.3 mmol/L) (מקור 12.5–47.3), סרין 32.7 mmol/L (מקור 18.0–73.0) ותראונין 17.7 mmol/L (10.8–74.9). לכל הילדים היה רצף אקסונים קליניים שלם.

[תרשים 1]

תרשים 1- אילנות יוחסין וגנוטיפים משפחתיים. המטופלים מיוצגים על-ידי סמלים בעלי מילוי והמטופלים, המהווים מדד, מיוצגים על-ידי חיצים. הגנוטיפ של המוטציות, המצויות בגופו של כל אחד ואחד, מופיעות מתחת לסמלים של הפרטים הזמינים.

לא הייתה היסטוריה של קרבת דם במשפחות מטופלים 1-9, וההורים של מטופל 10 היו ממוצא מעורב. אב AJ ואם עיראקית יהודייה. כל ההורים היו בריאים ובשתי משפחות היו שני אחים פגועים באופן דומה.
מטופלת 11 הייתה הילדה השנייה, אשר היו לה בני דודים מדרגה ראשונה ממוצא פלסטיני (תרשים 1). מצבה הרפואי היה חמור במידה ניכרת יותר מזה של המטופלים ה- AJ (טבלה 1). זמן קצר לאחר הלידה אובחנה דיספלזיה התפתחותית דו צדדית של הירך, אשר הצריכה גישה פתוחה. עיכוב התפתחותי כללי ומיקרוצפליה נרכשת הפכו להוכחה בגיל 4 חודשים. כשאושפזה בגיל 19 חודשים היו לה היפוטוניה צירית, מתח שרירים תקין ורפלקסים מוגזמים עמוקים בגידים.

לא היו תנועות רצוניות והמטופלת לא הייתה מסוגלת להתהפך.
תפקוד הראייה נפגע כפזילה דו צדדית, כקשר עין דל וכתגובה עצלה לאור בשתי העיניים. האלקטרורטינוגרפיה הייתה אנומלית בקנה מידה גדול והיו תגובות ברשתית העין, ואולם פוטנציאל הראייה, אשר התעורר, היה תקין. השמיעה יצאה ללא פגע, לפי תגובת גזע המוח השמיעתית וטימפנומטריה, והמטופלת נראתה כמזהה את קולות ההורים שלה, ברם לא היו לה מילים. תיעוד EEG בגיל הזה נשלט על-ידי גלים איטיים תמידיים יוצאי דופן , המפוזרים, המורכבים בעיקר מגלי דלתא ומפעילות תיטה גדושה איטית. היו עלייה חדה, או דילוג, בפעילות איטית בחלקו הקדמי [של המוח] ופעילות רקע איטית בצורה אנומלית בשעת פעילות עוצמתית בשני צדי החלק האחורי [של המוח]. ה-MRI של המוח בגיל 11 חודשים ו-19 חודשים קבע דלדול קליפתי ותת קליפתי מפוזר והיפומלינציה בחלקו העליון [של המוח] (תרשים 2G, H). חקירת מעבדה מקיפה כוללת creatine phosphokinase [אנזים], אמוניית סרום, חומצות אמינו ולקטאט, חומצות אורגניות בשתן ותבחינים אנזימטיים של תצמידי שרשרת הנשימה המיטוכונדרית ברקמת השריר וקבוצת אנזימים ליזוזומיים בבדיקת הכדוריות הלבנות היו כולם תקינים. יש לשים לב, כי פרופיל חומצת האמינו בנוזל המוח וחוט השדרה היה תקין גם כן (אלנין 41 mmol/L, סרין 43 mmol/L ותראונין 52 mmol/L).

שיטות
רצף אקסונים קליניים שלם
ניתוח האקסונים בוצע ב- DNAשל המטופלים ה- ,AJמטופלים 1-9, ושל ההורים שלהם ואף ב- DNAשל מטופלים 10 ו-11. יעדי האקסונים מומשו תוך שימוש ב- Agilent SureSelect Human All Exon V4 (50 Mb) kit (טכנולוגיות זריזות, סנטה קלרה, קליפורניה, ארצות הברית) ונערכו ברצף על-ידי מערכת הסידור ברצף “Illumina HiSeq 2000”, שלה 100 קוראים (Illumina, סן דייגו, קליפורניה, ארצות הברית) (לשיטות אנליטיות וביו-אינפורמטיביות מפורטות ראו חומר נוסף אונליין). הגדרת עוצמת המוביל בוצעה בקרב 860 AJ אנונימיים מבוגרים תוך שימוש ב-TaqMan RT-PCR7.

יצירת hASCT1-WT, E256K ו-R457W ותת שיבוטם
הוכנו שלושה פלסמידים (pUC57-Kan) בעלי השיבוטים הבאים: SLC1A4 מהסוג הפראי (WT), SLC1A4-, E256K ו-SLC1A4-R457W. נוספו תוויות של HA, של C-terminal, לכל שיבוט על-ידי PCR, אשר עברו אז תת שיבוט ל- pIRES2 DSRed-Express2. וקטור הבעה זה בעל שני ציסטרונים מאפשר הבעה בו זמנית של החלבון שלנו, מתוך כוונה, ושל DsRed-Express2 כדי לשלוט בשיעורי טרנספקציה שווים.

-L(H3) ואלנין-L נספגים בתאי HEK
תאי HEKעברו טרנספקציה תוך שימוש בליפופקטמין 2000 לצד pcDNA3.1, לצד hASCT1-WT, לצד E256K, או לצד R457W, על-פי פרוטוקול היצרן. כעבור יום מאז הטרנספקציה התפתחו תאים ב-100 mL של תמיסה נספגת, המכילה ריכוזים, אשר אוזכרו, של סרין-L, או של אלנין-L, כולל סרין-L(H3) 0.05 mCi, או אלנין-L, למשך 4 דקות.
לעצירת ניסויים ספיגת 25 סרין-L(H3) nM, כפי שנמדדה בהימצא המצעים הקרים, אשר היוו אינדיקטורים, או בלעדיהם. ספיגת מצעי H3 התגלתה ב- TopCount Microplate Scintillation and Luminescence Counter (PerkinElmer) (שיטה, המפורטת בחומר נוסף אונליין).

טבלה 1- מאפיינים קליניים של המטופלים

[טבלה 1]

תרשים 2

תרשים 2- (F-A) התאוששות המוח ממהפך של החדרת נוזל ב- .MRIמטופל 2 (C-A) בגיל 3 ומטופל 3 (F-D) בגיל 14 חודשים. חיתוכי צירים (A, B, D ו-E) ראויים לציון בעת מחסור בחומר לבן, בעת שימור חומר אפור. את הפחתת נפח החומר הלבן ניתן לראות בפיתול בקליפת המוח, לצד הגנגליונים הבזליים ולצד קצוות המעטפת הפנימית (A ו-D). ה- Centrum semiovale קטן אף הוא [האזור המרכזי של החומר הלבן] (B, E). חיתוכים ישרים באמצע (C, F) ראויים לציון בעת היפופלזיה של קליפת המוח, מה שמשפיע על כפיס המוח, על ה-splenium corpus [אחד מחלקי המוח] ועל החלק המקורי באותה מידה. (G ו-H) MRI של המוח, T2-weighted של מטופלת 11 בגיל 11 חודשים (G) ובגיל 19 חודשים (H), מה שמראה היפומלינציה בחלקו העליון [של המוח], לצד חומר לבן בכמות גבוהה באופן אנומלי, בנפח מופחת (מוגזם).
תרשים 3- רצף גנומי סביב המוטציות ודיון בגנים, שהפכו למוטציות (חיצים) בין מרכיבי ה-SLC1 האנושי.

[תרשים 3]

ניתוח נתוני העברת איזוטופים
נתוני השיעור (v) ההתחלתי של ה-hASCT1-WT, או ה-E256K, שעבר מוטציה, אשר תיווכו להעברת סרין-L(H3), תאמו למשוואה של Michaelis–Menten:

V= V[S]
(Km)+[S]

המשתנה הקבוע של Michaelis–Menten (Km) והמהירות המקסימלית של המוביל (Vmax) נקבעו.

ביוטינילציה על-פני השטח וספיגת חלבונים
ביוטינילציה על-פני שטח התאים
בוצעו ניסויים בביוטינילציה על-פני שטח התאים, כמתואר לעיל8 (שיטה, המפורטת בחומר נוסף).

סטטיסטיקות
הנתונים הושוו תוך שימוש במבחן ה- Uשל Mann–Whitney p<0.05 ללא פרמטרים ונחשבו מובהקים.

תוצאות
בקרב המטופלים ה- ,AJמטופלים 1-9, שימשו סינון משתנים ותעדוף (המפורטים בחומר נוסף אונליין) לזיהוי משתנה הומוזיגוטי יחיד חדש שלSLC1A4:NM_003038:c.766G>A; p.E256K, אשר אובחן בקרב כל תשעת הילדים הפגועים (ראו [חומר] נוסף אונליין, טבלה S1).
כל ההורים היו נשאים הטרוזיגוטיים (תרשים 1). משתנה ה- SLC1A4אושר לרצף של Sanger בקרב שבע משפחות, 1-7 (תרשים 3). היה סוג אחד משותף מ- chr2:65,237,863–66,798,282, שלו 19 משתנים משותפים, המורים, על כך ש- AJ p.E256K מהווה מוטציה מכוננת.
בקרב מטופל 10 גילה ניתוח האקסונים (המפורט בחומר נוסף אונליין) זוג אחד ותו לא של משתנים הטרוזיגוטיים, התואמים תורשה נסגנית, אשר קשורה לכרומוזומים, שאינם כרומוזומי מין. בגן ה- SLC1A4: היו p.E256K ו- NM_003038:c.944_945del, p.L315fs (תרשים 3).
בקרב מטופלת 11 גילה ניתוח האקסונים משתנים הומוזיגוטיים אחדים, ברם אולם שיקולים קליניים הובילו אותנו (המפורטים בחומר נוסף אונליין) להתמקד במשתנה הומוזיגוטי SLC1A4:NM_003038:c.1369C>T:p.R457W (תרשים 3). משתנה זה אושר על-ידי הרצף של Sanger ואובחן במשפחה יחד עם המחלה (תרשים 1).
SLC1A4 מקודד ASCT1, מוביל 532 חומצות אמינו ניטרליות. ASCT1 מהווה את אחד משבעת בני המשפחה, שבה קיים מוביל הגלוטומט האנושי, SLC1. שאריות ה- E256 וה- R457 נשמרים יפה באבולוציה, מהדג ועד האדם ואף בחלבוני משפחת ה- SLC1(תרשים 3).

[תרשים 4]

תרשים 4- הבעת הממברנה ותפקוד ה- hASCT1מהסוג הפראי (WT), E256K ו- R457W , שעברו מוטציות. (A) הבעת ממברנת הפלזמה של hASCT1-WT, המתויג כ- HAוהגנים, שעברו מוטציות, הוערכו על-ידי ספיגת החלבונים של חלבון ממברנת הפלזמה, המתויג על-ידי sulfo-NHS-LC-biotin, המבודד כטיפות סטרפטווידין של אגרוז (פנל שמאלי). חמישה מיקרוגרמים של סך כל הליזיס של תאי החלבון הוצבו לשם שליטה בהבעה זהה של ASCT1 WT ושל גנים, שעברו מוטציות (פנל ימני). פרוקסידאזים של חזרת הגינה ושל אבידין [קבוצת אנזימים] שימשו לגילוי ביוטין כחומר, המסייע לשליטה. היעדר הסימן לאקטין [סוג של חלבון] מאשר את טוהר חלקיקי הממברנה. מידת הספיגה של 25 mM סרין-L(H3) (B) ושל 25 mM אלנין-L(H3) (C) על-ידי תאי HEK, אשר עברו טרנספקציה, על-ידי המנגנונים, שנועדו לכך. הנתונים מהווים ממוצע±SD של 21 מקורות, המתאימים לשבעה שיבוטים טכניים, אשר נוצרו באמצעות שלושה ניסויים עצמאיים בחלבונים. **p<0.005 ל- hASCT1-E256K, או ל-R457W, לעומת WT. EV, וקטור ריק.

[תרשים 5]

תרשים 5- ניתוח קינטי של hASCT1 מהסוג הפראי (WT) ושל E256K. רמת החמצן בדם בעת העברת סרין-L(H3) (A) ואלנין-L(H3) (B) בעזרת תאי HEK293, המכילים hASCT1-WT ו-E256K. ספיגת רקע מתאים, אשר עברו טרנספקציה באמצעות וקטור ריק, פחתה בכל מצב. הנתונים מבוטאים באחוז המהירות המקסימלית של מוביל ה- WTומהווים ממוצעים ±SD של ארבעה מקורות על סמך שלושה ניסויים עצמאיים. (C) סיכום של הפרמטרים הקינטיים מושג על-ידי התאמת תוצאות הניסויים למשוואה של Michaelis–Menten. *p<0.05, **p<0.005 ל-hASCT1-E256K, לעומת WT.

מתוך 860 פרטים AJ אנונימיים בריאים נשאו שישה את מוטציית ה-p.E256K, מה שמורה על שיעור נשיאה של 1:144 בקהילה הזאת. מתוך ∼60 700 פרטים, אשר ניתוחי האקסונים שלהם היו זמינים ב-ExAC (קיבל גישה בינואר 2015) נשאו את מוטציית ה-p.E256K 21 ואת מוטציית ה- R457W נשאו 19 פרטים. בקבוצת אנשים זו לא היו הומוזיגוטים.
בשביל לחקור את השפעת תחליפי ה-p.E256K וה- R457Wב-ASCT1 ביטאנו את ה- WT ואת הגופים, שעברו מוטציות בתאי HEK, והערכנו את הביטוי הכולל של ממברנת הפלזמה שלהם וכמו-כן את יכולות ההעברה שלהם. תוך שימוש בגישת ביוטינילציה בחלבון בממברנת הפלזמה התגלה ה-ASCT1 הבשל, המכיל פלזמה (70–90 kDa) (תרשים 4A).

ביטוי ממברנת הפלזמה של ASCT1-E256K ושל -R457W היה דומה לזה של ASCT1-WT כמו לביטוי הכולל שלה. הצורה, שאינה בשלה, הייתה הצורה העיקרית, שנתגלתה בסך כל הליזיס. טוהר חלקיקי הממברנה וכמות כוללת שווה של חלבונים אושרה על-ידי אקטין, וכתם הביוטין הראה כמות שווה של חלבונים בממברנת הפלזמה. תפקוד שלושת החומרים הוערך על-ידי מדידת מידת הספיגה של 25 mM סרין-L(H3), או של 25 mM אלנין-L(H3) בתאי HEK. לא נצפתה שום העברה ספציפית ברת מדידה של hASCT1R457W- ל- ASCT1-R457W באף אחד משני המצעים. הספיגה של סרין-L ושל אלנין-L ב- ASCT1-E256K פחתה ב- ∼25% וב- 20%, בהתאמה, בהשוואה למוטציה מהסוג הפראי (תרשים 4B, C).

מכיוון שהספיגה הספציפית של hASCT1-R457W הייתה מתחת לרמת המדידה בכל הריכוזים, אשר נבחנו (הנתונים אינם מופיעים), גנים אלה, אשר עברו מוטציות, לא נחקרו לעומק.
ספיגת ה- סרין-L וה- אלנין-L התלויה בריכוז, נקבעה לגבי hASCT1-WT ולגבי E256K להשגת הפרמטרים הקינטיים שלהם ולהשוואה ביניהם (תרשים 5). המהירות המקסימלית של hASCT1-E256K פחתה בצורה דרסטית על-ידי השוואה בין 50% לפחות של המובילים ה- WT בשני המצעים. באופן מפתיע, נקודות הדמיון בין ה- סרין-L לבין ה-אלנין-L היו גדולות פי שלושה ופי שניים בהתאמה, רבות יותר ב-hASCT1-E256K. ספציפיות המצעים הוערכה אז בעזרת עריכת ניסויים תוך שימוש במצעים ידועים של ASCT1, כמו L-
תראונין, כמו L-asparagine וכמו L-valine (תרשים 6). דפוס תחרות דומה נצפה בקרב כל המצעים, אשר נבחנו ל- ASCT1-WTול-E256K. מעצור מקיף חזק יותר נצפה במוביל, שעבר מוטציה, מה שמשקף את נקודות הדמיון הרבות יותר של המצע, בהשוואה ל-WT.

דיון
פה אנו מדווחים על 11 מטופלים, אשר ייצגו עיכוב התפתחותי כללי, מיקרוצפליה והיפומלינציה. ניתוחי אקסונים שיקפו שלוש מוטציות בגן ה-SCL1A4, בגן ה- p.E256K, בגן ה- p.L315fs ובגן ה-p.R457W. המוטציות, שעברו החלפת חומצות אמינו, משפיעות על שאריות, אשר נשמרו היטב היטב, הופרדו ממצב המחלה במשפחות, והן נדירות בקרב קבוצה גדולה של פרטים, אשר שימשה כקבוצת ביקורת.

SLC1A4 מקודדת את מוביל חומצות האמינו הניטרלי, ASCT1, מוביל ה- סרין-L העיקרי במוח. עת שהובעו במערכת הטרולוגית, לא השפיעו מוטציות אלו על הבעת סך כל החלבונים, או על ממברנת הפלזמה, עם זאת קושרו לאי העברת ה- סרין-L והאלנין למוטציית ה- R457W והפחיתו בצורה דרסטית את ה- Vmax למוטציית ה-p.E256K. למרבה העניין, המוטציה השנייה הגבירה את נקודות הדמיון בין שני המצעים. יחד עם זאת בהשוואה ל- hASCT1 WT, הפגינה מוטציה זו סלקטיביות דומה בחמשת המצעים, אשר נבחנו. הממצאים מאששים את המובהקו∙ת התפקודית של מוטציות ה-SLC1A4, אשר זוהו.

[תרשים 6]

תרשים 6- מניעת ספיגת חומצות האמינו של סרין-L(H3) על-ידי תאי HEK293, המביעים ASCT1 מהסוג הפראי (WT) ו-.E256K ספיגת 25 סרין-L(H3) nM נמדדה בהימצא 250 mM של חומצות האמינו, אשר נמצאו. הנתונים מובעים באחוזי הספיגה בהיעדר חומצות אמינו קרות ומייצגים את הממוצע ±SD של ארבעה ניסויים, שכל אחד מהם נערך בשלוש חזרות טכניות.
אף קבענו את שכיחות משתנה ה- SLC1A4 p.E256Kבקרב הנשאים באוכלוסייה ה-AJ כ-0.7%, לכן אנו ממליצים להוסיף מוטציה זו לפנל המיסוך של הנשאים ה-AJ.

כנזכר לעיל, החדירו∙ת הדלה של המחסום בדם ובמוח למעבר L-serine3 מכתיבה את הסינתזה שלו במוח.
בתקופה, שלאחר הלידה, עובר סרין-L סינתזה בולטת באסטרוציטים ולא בנוירונים בעקבות הביטוי השונה של האנזימים הביו-סינתטיים בתאים הללו4. עקב כך נחשב סרין-L לחומצת אמינו, הדרושה לנוירונים, נחוץ מוביל, המיועד לכך, ASCT1, להוציא אותם מאזור הניתוח, להעביר אסטרוציטים למקום הפעולה שלהם, לתאי הנוירונים. בתאי היונקים קיימים כמה מובילי חומצות אמינו: 1. מערכת העברת Na+ בלתי תלויה, ASC (יתרון בולט ל-Alaל-, Ser ול-Cys): ASCT1 (SLC1A4) ו- ASCT2 (SLC1A5). 2. מערכת A (יתרון בולט ל- Ala, ל- Serול-Gln:) SNAT1 ((SLC38A1) ו-SNAT2 (SLC38A2); 3) מוביל 1 Na+ בלתי עצמאי מאלנין, מסרין ומציסטאין (Asc-1 (SLC7A10) נסקר במקור 9). הדיווח הנוכחי מדגיש, כי ASCT1 נדרש להעברת סרין בנוירונים. רמת הסרין התקינה בנוזל המוח וחוט השדרה של המטופלים מציעה, כי מובילים אחרים כ-SNAT5 אחראים על סילוק ה- סרין-L מהאסטרוציטים אל נוזל המוח וחוט השדרה.
ASCT1 גם זוהה ברקמות שאינן עצביות, במערכת העיכול, באפיתליה מרובדת של הלשון, ממברנות הפלזמה של תאי הבטן הבזאליים, של התאים במעי הדק, של תאי הכבד ושל תאי בלוטות הרוק, המורכבים מאונות קטנות ולבלב אקסוקריני. ASCT1 התגלה גם כן בממברנת הפלזמה של תאי האפיתליה של אבובית הכליה ושל תאים תומכים בלשד יותרת הכליה10. בצד זאת הסימנים הנוירולוגיים המועדפים וחוסר המעורבות של מערכות גוף אחרות בקרב המטופלים שלנו מצביעים, על כך ASCT1 אנושי דרוש למערכת העצבים המרכזית גרידא.
סרין-L עובר סינתזה מ-3-פוספוגליצריד מתווך גליקוליטי דרך שלוש תגובות עוקבות לחומר מזרז.

פגמים בביו-סינתזה של ה-סרין-L (MIM 601815, 610992, 614023) קשורים להיותה קטלנית לעוברי עכברים, בעת התפתחות פסיכו-מוטורית לקויה למדי נעצרת ההתפתחות במהלך שנת החיים הראשונה, חלים הפרעת פרכוסים, דלדול מוחי ודלדול מיאלין בקרב בני אדם (נסקר במקור 12). לאחרונה דווח על רצף פגמים בהיריון ובינקות (תסמונת ניו לקסובה (MIM) 256520)) בקשר לפגמים בביו-סינתזה של ה-סרין-13L. המטופלים דיווחו בזאת בדומה על הטרוגניות קלינית ותאית כלשהי, אשר ודאי מורה על מתאם פנוטיפ-גנוטיפ. לעומת זאת רובם נבדלים ממטופלים, אשר דיווחו על פגמים בביו-סינתזה של ה-סרין-L בהתקיים HC תקין בלידה, אשר לבטח מיוחס לביטוי ההורי של האנזימים הביו-סינתטיים בתאי העצב4, בהיעדר הפרעת פרכוסים חמורה וברמת סרין תקינה בנוזל המוח וחוט השדרה.

לבסוף אנו חושדים, כי אולי מוצדק ניסוי טיפולי ב-סרין-L בקרב מטופלים, הסובלים מפגם ב- SLC1A4. למרות החדירו∙ת הדלה של ה-סרין-L למחסום בדם ובמוח טיפול במטופלים, הסובלים מפגמים בביו-סינתזה של ה-סרין-L, נראה מועיל, מקל על חומרת הפרכוסים ועל תדירותם6,14.