חיפוש
סגור את תיבת החיפוש

מוטציות ב-SLC1A4 גורמות הפרעה חדשה

מוטציות ב-SLC1A4 גורמות הפרעה חדשה של מגבלה אינטלקטואלית, של מיקרוצפליה פרוגרסיבית ושל ספסטיות וכן גורמות כפיס מוח דק
היימר, ג., מרק-יגל, ד., אייל, א., בר-אל, א., עוז-לוי, ד., הופמן, ק., רוזו, א. ק., גנלין-כהן, א., לנצט, ד., פרס, א., רחבי, ג., ניסנקורן, א., אניקסטר, י., גולדשטיין, ד. ב., בן-זאב, ב., .

“מוטציות ב-SLC1A4 גורמות הפרעה חדשה של מגבלה אינטלקטואלית, של מיקרוצפליה פרוגרסיבית ושל ספסטיות וכן גורמות כפיס מוח דק”

Clin Genet 2015: 88: 327–335. © John Wiley & Sons A/S. פורסם על-ידי John Wiley & Sons בע”מ, 2015
ג. היימרa,b, ד. מרק-יגלc, א. איילd, א. בר-אל d, ד. עוז-לויe, ק. הופמןf, א. ק. רוזוg, א. גנלין-כהןa, ד. לנצטe, א. פרסh.i, ג. רחביd, j, א. ניסנקורןa.i, י. אניקסטר.ic, ד. ב. גולדשטיין j ו- ב. בן-זאב a.i

a היחידה לנוירולוגיית ילדים, בית החולים לילדים “אדמונד ולילי ספרא”,

b תכנית המנהיגות הרפואית במרכז “פנחס בורנשטיין תלפיות”,

c היחידה למחלות מטבוליות, בית החולים לילדים “אדמונד ולילי ספרא”,

d המרכז לחקר הסרטן, היחידה להמטולוגיית ילדים/לאונקולוגיית ילדים, בית החולים לילדים “אדמונד ולילי ספרא”, המרכז הרפואי על-שם חיים שיבא, רמת גן, ישראל,

e המחלקה לגנטיקה מולקולרית, מכון ויצמן למדע, רחובות, ישראל,

f היחידה לדימות [במקור: Diagnostic Imaging Unit,] המרכז הרפואי על-שם חיים שיבא, רמת גן, ישראל,

g המרכז לשינוי הגנום האנושי, בית הספר לרפואה של אוניברסיטת דיוק, דוהם, NC, ארצות הברית,

h מכון Danek Gertner לגנטיקה אנושית, המרכז הרפואי על-שם חיים שיבא, רמת גן, ישראל, .

i הפקולטה לרפואה על-שם סאקלר, אוניברסיטת תל אביב, תל אביב, ישראל והמכון לרפואת הגנום האנושי, בית הספר לרפואה של אוניברסיטת קולומביה, המרכז הרפואי של אוניברסיטת קולומביה, ניו יורק, NY, ארצות הברית

מילות מפתח: מיקרוצפליה נרכשת – ASCT1 – דלדול מוחי, עיכוב מנטלי, פרכוסים, סרין, SLC1A4, קוואדרופלגיה ספסטית, כפיס מוח דק.


ליצירת קשר עם הכותבת: פרופסור ברוריה בן זאב, היחידה לנוירולוגיית ילדים, בית החולים לילדים “אדמונד ולילי ספרא”, המרכז הרפואי על-שם חיים שיבא, רמת גן, 52621, ישראל

טלפון: +972 3 5302687
פקס: +972 3 5305031
אימייל: bruria.benzeev@sheba.health.gov.il
נתקבל ב-29 במאי 2015, תוקן והותר לפרסום ב-30 ביוני 2015

שני מטופלים, אשר אינם קשורים זה לזה, המיוצגים על-ידי עיכוב התפתחותי כללי מובהק, על-ידי מיקרוצפליה פרוגרסיבית חמורה, על-ידי פרכוסים, על-ידי ספסטיות ועל-ידי כפיס מוח דק (CC), עברו רצף אקסונים משולש. לא נמצא אף משתנה, שהיה קנדידט, באף גן ידוע, הקשור לפנוטיפ. אך הצלבת נתוני המטופלים המחישה, כי הם שניהם הפגינו משתנים פתוגניים בגן ה-SLC1A4, אשר מקודד את מוביל הסרין, ASCT1, וחומצות אמינו ניטרליות אחרות. המטופל האשכנזי הומוזיגוטי בקשר להחלפת חומצות אמינו מזיקה במוטציית ה- c.766G>A, p.(E256K), בעוד המטופל האשכנזי-העראקי הטרוזיגוטי, בעל מוטציה זו ומוטציית c.945delTT, p.(Leu315Hisfs*42) חסרת המשמעות.

חיזוי מבני קובע, כי יש לקצץ נתח מובהק של חלבון על-ידי המוטציה חסרת המשמעות ומטיל ספקולציות בהפרעה התפקודית בעזרת המוטציה חסרת המשמעות. שתי המוטציות נדירות למדי בבסיס נתוני האוכלוסייה הכללית, אבל המוטציה, הקשורה להחלפת חומצות אמינו, נמצאה הטרוזיגוטית ביחס של 1:100 בקרב קבוצת הביקורת היהודית האשכנזית, המציעה שיעור נשאים גבוה יותר בקרב יהודים אשכנזים. אנו מסיקים, כי SLC1A4 מהווה את הגן, הגורם למחלות, להפרעה הנוירולוגית החדשה, המופגנת בהימצא מגבלה אינטלקטואלית מובהקת, מיקרוצפליה חמורה לאחר הלידה, ספסטיות ו-CC דק. תפקיד ה-SLC1A4 בהעברת הסרין מהאסטרוציטים אל הנוירונים מציע פתומכניזם אפשרי למחלה זו ומורה על גישה טיפולית פוטנציאלית.

ניגוד אינטרסים
הכותבים אינם מצהירים על שום ניגוד אינטרסים פוטנציאלי מתוך כבוד למחקר, לכתיבה ו/או לפרסום מאמר זה.

מגבלה אינטלקטואלית (ID) , מיקרוצפליה וספסטיות, לצד הפרעת פרכוסים, או בלעדיה, שכיחות ומהוות מאפיינים בלתי ספציפיים, המשותפים להרבה הפרעות נוירו-התפתחותיות ונוירו-מטבוליות לרוב בילדו∙ת (2, 1). בהיעדר דיסמורפולוגיה ייחודית, או אנומליות מטבוליות, שאובחנו, גישת האבחון הכי טובה בימינו היא בדיקה גנטית רחבת ידיים כסידור ברצף של הגנום האנושי כולו. אולם בהתפרץ מחלה חדשה, אשר גורמים גנים, קשה מכל לזהות את המשתנה, הגורם למחלה, בעת ניתוח מטופל יחיד.

אנו מציגים פה את הדיווח השני המאומת בדבר מחלה חדשה, אשר גורם הגן, SLC1A4, אשר גילינו באופן עצמאי באמצעות הצלבת נתוני רצף הגנום האנושי כולו של שני מטופלים, אשר אינם קשורים זה לזה, המאופיינים ב- IDמובהק, במיקרוצפליה פרוגרסיבית, בפרכוסים, בספסטיות, בדלדול מוחי קל ובכפיס מוח דק (CC). אחד מהמטופלים הומוזיגוטי בנוגע לאותה מוטציית c.766G>A, p.(E256K), הקשורה להחלפת חומצות אמינו, אשר דווח עליה בעבודתה של הקבוצה של Michaud, אשר פורסמה באינטרנט זה עתה (3), בעוד השנייה בעלת מוטציה זו, ההטרוזיגוטית, בעלת מוטציה, אשר עברה שינוי מסגרת ואשר לא דווח עליה בעבר, c.945delTT, p.(Leu315Hisfs*42), בגן ה-SLC1A4. אנו מראים תוצאות של ניתוח מבני, המנבא פתוגניות של שתי המוטציות והמציג נתוני מיסוך אוכלוסייה.

חשיפת שני מטופלים נוספים, אשר אינם קשורים זה לזה, בעלי פנוטיפ דומה ובעלי מוטציה נוספת מזיקה מאד של גן זה מאשרת את תפקיד ה-SLC1A4 בגן, הגורם למחלות, להפרעה נוירו-מטבולית נוספת, המופיעים לצד ID, לצד מיקרוצפליה פרוגרסיבית, לצד ספסטיות ולצד CC דק בדימות תהודה מגנטית (MRI). דפוסי ההבעה הייחודיים של מוביל חומצת האמינו הניטרלית של ASCT1, אשר קודד על-ידי ה-SLC1A4 ועל-פי התפקוד שלו בהעברת הסרין אל מערכת העצבים המרכזית, במיוחד מהאסטרוציטים אל הנוירונים, מציע הסבר לחלק מהמאפיינים הקליניים ואולי אפילו מציע גישה טיפולית אפשרית, המתבססת על הוספת סרין.

חומרים ושיטות
הסכמה אתית
המחקרים המולקולריים אושרו על-ידי ועדת האתיקה של המרכז הרפואי “שיבא” ושל משרד הבריאות הישראלי. הושגה הסכמה מדעת כתובה מכל המשתתפים, או מהאפוטרופוסים המשפטיים שלהם.

סידור ברצף של הגנום האנושי כולו ואמצעי העברת ביו-אינפורמטיקה ה-DNA הוצא בבדיקת דם ובוצע סידור ברצף של הגנום האנושי כולו ב-” Center for Human Genome Variation”, אוניברסיטת דיוק, בית הספר לרפואה, דוהם, צפון קרוליינה, ארצות הברית.

כדי לאתר את אזורי הקידוד, ה- 65-Mb IlluminaTruSeq Exome Enrichment Kit (Illumina, San Diego, ה-CA), 64-Mb Roche NimbleGen SeqCap EZ ExomeLibrary Kit (Roche NimbleGen, Madison, WI), או ה- 50-Mb Agilent SureSelect, היה בשימוש הגנום האנושי כולו (אגילנט, סנטה קלרה, קליפורניה). סוג איתור המערך עלה בקנה אחד עם שלישיה נתונה. כל הסידור ברצף בוצע בפלטפורמת ה- Illumina HiSeq 2000 (Illumina). תוך שימוש ב- Burrows-Wheeler Aligner (BWA-0.5.10) (4), מופו הקריאות לסידור ברצף ל-Genome Reference Consortium Human.

מערך הגנום ה-Build 37, המבוסס על (GRCh37), כולל רצפי מלכודת. אותו גנום, המשמש מקור, משמש בפרויקט אלף הגנומים(http://www.1000genomes.org/) . שכפולי תגובת השרשרת של הפולימרים (PCR) הוסרו תוך שימוש באמצעי picard-tools-1.59 (http://picard.sourceforge.net).
משתנים בעלי נוקלאוטיד יחיד והחדרות/מחיקות קלות (indels) בוצעו תוך שימוש בגנוטיפר המאוחד לניתוח הגנום “Toolkit” (gatk-1.6–11) (5) ותוך שימוש מלווה בהערות ב- SnpEff-3.3 (בסיס הנתונים של אנסמבל 73) (6).

רשימת “גנוטיפים מתאימים” חוברה לכל שלישיה תוך שימוש בנתוני רצף הגנום האנושי כולו של השלישיה בלוויית נתוני השכיחות אין סיליקו ובלוויית נתוני שכיחות המשתנים הגנטיים באוכלוסייה המקומית.
במושגי תפקוד נכללו אך ורק משתנים, הגורמים לשינוי בחלבונים, כולל משתני קיטום (הפסקת רווח/אובדן, תחילת אובדן, או שינוי מסגרת), משתנים, הקשורים להחלפת חומצות אמינו, משתנים, ההולמים את הכללים, הכוללים החדרות ומחיקות, indels, הנכללים במסגרת, המשפיעים על תחומי קידוד החלבונים, ומשתנים בגבול האינטרון-אקסון (שמונה בסיסים, המאגפים את גבולות האקסונים).

המוקד העיקרי היה היעדר גנוטיפים במערכי נתוני הביקורת ובאופן שיטתי הובאו בחשבון שלושה מודלים גנטיים שונים תוך שימוש ברבדי אמריקנים אירופאים ואפריקנים-אמריקנים ב- Exon Variant Server (EVS) להערכות שכיחות האלל המינורי: (i) מוטציות, שנכללו שוב בקו החיידקים, חסרות גם באוכלוסיות הביקורת הזמינות, (ii) גנוטיפים הומוזיגוטיים נסגניים, אשר היו הטרוזיגוטיים בקרב שני ההורים, מעולם לא היו הומוזיגוטיים בקרב חברי קבוצת הביקורת, אשר בקרבם עמדה שכיחות האלל על <1% ו-(iii) גנוטיפים הטרוזיגוטיים מלוכדים בקרב מטופל, אשר בקרבו לא היה אף משתנה הומוזיגוטי, מבין חברי קבוצת הביקורת. בקרב כל אחד מהם עמדה שכיחות האלל על <1% וזאת מבלי להתייחס להצגה בשלבים. שני המשתנים אף פעם לא נמצאו יחד בקרב חברי קבוצת הביקורת של “Center for Human Genome Variation”. גנוטיפים, העונים על קריטריונים אלה, נחשבו ל-“גנוטיפים מתאימים” והגנים, הטומנים בחובם גנוטיפים מתאימים, נחשבו ל-“גנים מתאימים”.

בקרב שתי השלישיות נבדקה רשימת הגנים המתאימים, ספציפית למול OMIM, תוך דרישה, כי (i) הפנוטיפ של מחלת ה- OMIMיחפוף את המאפיינים הקליניים של המטופל, (ii) הגנוטיפ המתאים עלה בקנה אחד עם דפוס תורשת ה-OMIM, אשר עליו דווח (למשל, דומיננטי, או נסגני), ו-(iii) דווח על המוטציה המתאימה עצמה בקרב מטופל, אשר הושפע ממנה באופן דומה, או המוטציה המתאימה, אשר נכללה באותה קטגוריית תפקוד (למשל, אובדן תפקוד, קשר להחלפת חומצות אמינו), כאלו אשר עליהן דווח בקרב מטופל, אשר הושפע מהן באופן דומה.

קביעת התקפות של Sanger ומיסוך האוכלוסייה
השימוש ב-DNA הוגבר ב-25 μl תגובות, המכילות 50 ng של DNA, 10 pmol של כל פריימר, ddH2O ו-Red load Taq Master*5) LAROVA GmbH , גרמניה). לאחר דנוטרציה ראשונית של 5 דקות ב-95 מעלות צלזיוס בוצעו 35 מחזורים (94 מעלות צלזיוס 30 פעמים, 56-60 מעלות צלזיוס 30 פעמים ו-72מעלות צלזיוס 30 פעמים) לצד הארכה סופית של 10 דקות ב-72מעלות צלזיוס. מיסוך מוטציית ה- 945delTTבקרב בני המשפחה ובקרב יהודים יוצאי עראק חברי קבוצת ביקורת בוצע בעזרת שני פריימרים פלואורניים, F-GAAAGACATCATCGTGCTGGT ו-R-caaaacccactcacCTGGAG. איגוף הפריימרים את המוטציה ב- 197 bp PCRמהווה תוצר באלל התקין ו-195 bp PCR מהווה תוצר באלל, שעבר מוטציה. האמפליקונים התרבו במצב, שתואר לעיל, ונותחו באמצעות המנתח הגנטי האוטומטי ABI 3130/3130XL, Applied Biosystems, קליפורניה, ארצות הברית.

מיסוך מוטציית ה- E256Kבקרב בני המשפחה ובקרב יהודים אשכנזים חברי קבוצת ביקורת בוצע בעזרת הפריימרים הבאים, f-ttgttctatcctctctgatcctg ו- R-AGGACACCAGCACCATCGTCGaCT. “g” יחיד לשינוי “a” הוחדר לפריימר השני כדי ליצור אזור מוגבל לאנזים, Hinf1, בכרומוזומים התקינים. אזור מוגבל זה נועד לתקפות ולבידול במשפחה למיסוך 100 יהודים אשכנזים חברי קבוצת ביקורת.

הערכת הפתוגניות של המשתנה ושל השכיחות שלו
השפעת המוטציה הוערכה תוך שימוש במגוון תכניות, כולל sift (7), כולל MutationAssessor (8), כולל MutationTaster (9) , polyphen2 (10), lrt (11),
snap2 (12) וכולל MetaSVM(13). מערך רצף חלבוני ASCT1 מסוגים למכביר נבנה תוך שימוש ב- clustalW (14).

שכיחות שני המשתנים הוערכה תוך שימוש בבסיסי הנתונים הבאים: אלף הגנומים, אמריקנים אירופאים, אפריקנים-אמריקנים, ExAC (http://exac.broadinstitute.org), פרויקט הגנום האשכנזי ובסיס הנתונים הפנימי של האקסונים.

ניתוח מבני
מודל מבני של חלבון ה- ASCT1נבנה על-פי דגם “המודל השוויצרי” (15). מודל ההומולוגיה גובש בלוויית תכנית ה-promod-II. חלבון ה- Glutamate symport מזן ארכאוני (Pyrococcus horikoshii), pdb file 4oyf, שימש כתבנית בתהליך הזה. ASCT1 אנושי והחלבונים התבניתיים חולקים 31.5% זהות. תבניות נוספות, שבהן רצף זהה קצת פחות, הניב מודלים דומים במקצת. Jmol (16) שימש לחזותיות וליצירת דימויים מבניים.

תוצאות
תיאור המקרה

המטופלת הראשונה (תרשים 1a,3:II) היא ילדה בת 4.5, הצעירה מבין שלושה ילדים, להורים ממוצא מעורב יהודי אשכנזי-עראקי, צאצאית חסרת קרבת דם ובלא מחלות גנטיות ספציפיות ידועות במשפחה, מלבד לבקנות אצל האב (תרשים 1a,1: I). היא נולדה בזמן, אחרי הריון רגיל ואחרי לידה רגילה. מתח שרירים גבוה ועיכוב התפתחותי כללי נראו בגיל חודשיים. פרכוסים עקב מתח שרירים גבוה החלו בגיל 11 חודשים (EEG) ואלקטרואנצפלוגרם שיקף שבירות גלים ועלייה חדה כללית ועורפית בהם. מיסוך מקיף, כולל דם, וחומצות אמינו של נוזל המוח וחוט השדרה (lactate) וחומצות שתן אורגניות, היה תקין. לקטאט ה- lactateהוגבר, בעת שהתלווה אליו פרכוס, ואולם הדוגמא החוזרת הייתה תקינה, כמו הסידור ברצף של גן ה- PDHE1A ושל תפקוד האנזימים בשרשרת הנשימתית בביופסיה של השרירים.

האקוקרדיוגרם והסונוגרם של הבטן היו תקינים. בדיקת עיניים שיקפה לבקנות עינית של האב ללא אנומליות אחרות והתעוררו במוח תגובות שמיעתיות תקינות. MRI, אשר בוצע בגיל שנה ובגיל ארבע, קבע CC דק, עיכוב בהעברת המיאלין ודלדול מוחי (תרשים 2a,b), בעוד לא אובחנה שום אנומליה בספקטרוסקופיה. בהווה, בגיל 4.5, היא מפגינה פרכוסים מיקולוניים מדי יום ביומו וכמותם גם רגזנות, היפראקטיביות, הפרעת שינה, תנועות ידיים רצוניות פחותות וסטריאוטיפים. בנוסף, היא מתאפיינת בעיכוב התפתחותי כללי חמור, היא זוחלת על בטנה הרכה, מחזיקה חפצים ומעבירה אותם מיד אחת לשנייה ולפה שלה, ברם היא אינה יושבת בלי תמיכה, כמו-כן אינן לה קשר עין עקבי, לא מלמול, או צחוק חברתי, והיא אינה מסוגלת לאכול מזון מוצק. בדיקות חוזרות קבעו מיקרוצפליה פרוגרסיבית חמורה (באחוזון ה-25 בלידה), – 3 סטיות תקן (SD) בשנה אחת ו-4 SD בשנתיים וחצי וכעת, מה שמגביר ספסטיות מקומית ברפלקסים חדים וברפלקס דו צדדי בשריר מותח בכף הרגל. לא אובחן דיסמורפיזם גס.
המטופלת השנייה (תרשים 1b,5:II) היא ילדה בת 6, הצעירה מבין חמישה ילדים, להורים ממוצא מעורב יהודי אשכנזי, צאצאית חסרת קרבת דם. דווח, כי אחותה הגדולה (תרשים 1b,5:II) סבלה מפרכוסים, המלווים בחום, מעיכוב התפתחותי, ממיקרוצפליה פרוגרסיבית ומספסטיות, כמו גם מאפיזודות אחדות קשורות, המלוות בחום ובעוויתות, המוערכות כקשורות לכבד. היא מתה לפתע בגיל 22 חודשים, בנסיבות בלתי מוסברות. המטופלת המוכרת לנו נולדה בזמן, אחרי הריון רגיל ואחרי לידה רגילה. אובחן עיכוב התפתחותי כללי בגיל 7 חודשים והתחילו פרכוסים, המלווים בחום, בגיל שנה. בדומה לאחותה המתה, אף היא הפגינה חום חוזר ונשנה, הקשור להפרעות פתאומיות בתפקוד הכבד שלה. בדיקת אבחון מטבולית מקיפה לא סיפקה מידע, לא על לקטאט הדם, לא על אמוניה, לא על חומצות אמינו ולא על חומצות שתן אורגניות. אקוקרדיוגרם, אולטרה-סאונד של הבטן ובדיקת עיניים היו תקינות. EEG קבע פעילות תיטה-דלתא איטית בלי פעילות מובנת מאליה דמוית אפילפסיה.
MRI, אשר בוצע בגיל 2.5, קבע דלדול מוחי קל ו- CCדק (תרשים 2d,c) לצד ספקטרוסקופיה תקינה. בהווה, בגיל 6, היא מפגינה עיכוב התפתחותי כללי חמור בעל מאפיינים דומים לשל רגזנות, לשל היפראקטיביות, לשל הפרעת שינה ושל סטריאוטיפים, כשל המטופלת הראשונה.

אף על-פי כן, הרמה התפקודית שלה טובה יותר, בהשוואה למטופלת הראשונה – היא זוחלת על ידיה ועל ברכיה, הולכת בסיוע, יכולה לאכול בכוחות עצמה בכפית, בעלת קשר עין טוב, מפטפטת וצוחקת בקול. בבדיקות חוזרות נמצאה מיקרוצפליה פרוגרסיבית חמורה (באחוזון ה-50 בלידה, 2 SD בגיל שנה וחצי, 3 SD בגיל שלוש ו-4 SD בגיל חמש), מה שמגביר את הספסטיות המקומית ברפלקסים חדים וברפלקס דו צדדי בשריר מותח בכף הרגל. גם פה לא אובחן דיסמורפיזם גס.

סידור אקסונים ברצף
סידור שלישיית אקסונים ברצף בוצע במטופלת הראשונה והניב מחדש שני משתנים, משתנה הומוזיגוטי חדש אחד ו-15 משתנים הטרוזיגוטיים מורכבים, אשר שרדו את תהליך הסינון, המתואר בשיטות (טבלה 1S, מידע תומך). ברם אולם על אף אחד מהם לא דווח בעבר בהקשר של הפנוטיפ של המטופלת.
סידור שלישיית אקסונים ברצף בוצע במטופלת השנייה והניב מחדש שלושה משתנים, משתנה הומוזיגוטי חדש אחד ו-11 משתנים הטרוזיגוטיים מורכבים, אשר שרדו את תהליך הסינון, המתואר בשיטות (טבלה 2S). שוב, על אף אחד מהם לא דווח בעבר בהקשר של הפנוטיפ של המטופלת. הצלבת נתוני שתי המטופלות שיקפה גן אחד ויחיד, SLC1A4, אשר שתי המטופלות חלקו משתנים מובהקים שלו.

המטופלת האשכנזייה הייתה הומוזיגוטית למוטציה (NM_003038.4), הקשורה להחלפת חומצות אמינו c.766G>A, p.(E256K), בעוד המטופלת השנייה, צאצאית של אשכנזי-עראקי, הפכה להטרוזיגוטית למוטציה זו, הקשורה להחלפת חומצות אמינו c.766G>A, p.(E256K), ולמוטציה חסרת משמעות c.945delTT, p.(Leu315Hisfs*42) (NM_003038.4).

המוטציות אושרו על-ידי הסידור ברצף של Sanger ונקבעה הפרדה מושלמת בין המשפחות (תרשים 1a,b).
רוב כלי הניבוי המותאמים מנבאים, כי תת המוטציה, E256K, יהיה בעל השפעה פתוגנית: sift (7), MutationAssessor (8) ו- MutationTaster(9) מנבאים, כי המשתנה יזיק, polyphen2 (10) מעריך, כי המשתנה הזה עלול להזיק וכי lrt (11) מעניק ציון בלתי ודאי בניבוי. מטה-מנבאים, אשר משלבים תכניות לרוב לציון משולב אמין יותר, מעריכים, כי המשתנה הזה מזיק (13). snap2, המשולב ב- predictProtein server מילולית: מנבא חלבונים אף מציע, כי המוטציה מזיקה וכי היא ממוקמת באזור רגיש למוטציות (תרשים 3), על אף שיש אזורים רגישים אפילו יותר בהימצא החלבון. מערך הרצף, המרובה clustalW (14), קבע, כי E256 נוצרה בשלב התפתחותי מוקדם הרבה יותר.

מיסוך האוכלוסייה
מוטציית ה- ,c.766G>A הקשורה להחלפת חומצות אמינו, נדירה עד מאד בקרב האוכלוסייה הכללית. השכיחות ההטרוזיגוטית, אשר נמצאה בבסיסי הנתונים הבאים, הייתה: אלף הגנומים: 0, אמריקנים אירופאים: 1/8599 (0.0001), אפריקנים-אמריקנים: 0/4406 (0), ExAC: 21/120,744 אללים, פרויקט הגנום האשכנזי: 0/256 אללים, בסיס הנתונים הפנימי של האקסונים: 0/314 אללים ולא נמצאו פרטים הומוזיגוטיים. כפי שקורה למוטציית ה-c.945delTT, p.(Leu315Hisfs42), באף אחד מבסיסי הנתונים דלעיל לא נמצאו פרטים הומוזיגוטיים ולא הטרוזיגוטיים.

מיסוך 100 היהודים האשכנזים מקבוצת הביקורת של המוטציה, הקשורה להחלפת חומצות אמינו, c.766G>A, p.(E256K), שיקף נושא הטרוזיגוטי אחד, בעוד לא נתגלו נשאים בקרב 100 היהודים העראקים מקבוצת הביקורת של המיסוך במוטציה חסרת המשמעות, c.945delTT, p.(Leu315Hisfs42).

ניתוח מבני
כשם שתואר ב-“שיטות”, גיבשנו מודל מבני של [חלבון] ה- ASCT1 האנושי תוך שימוש ב-“מודל השוויצרי” (15) בשביל לגבש תובנה טובה יותר, בדבר ההשפעה המבנית והתפקודית של המוטציות. ביותר מ-30% זהות עם המובילים האחרים, המבוססים על מודלים של זהות בעלי מבנה פתור, על מודלים של ASCT1, צפויה איכות טובה. המבנה החזוי (תרשים 5a) קובע, כי מוטציית c.945delTT, אשר עברה שינוי מסגרת, גורמת התאמה וקיטוע של חלק מרכזי של הפוליפטיד (תרשים 5b). Glu256, אשר הוחלפה בליזין בשל מוטציית ה- c.766G>A, הקשורה להחלפת חומצות אמינו, מנובא כממוקם לצד סליל ממברנה ארוך, קרוב לחלק הציטופלזמה של המוביל.

בהנחה, שהחלבון הומו-טרימר, מפני שישנם הרבה מובילים הומולוגיים אחרים, צפוי גם, כי הוא יימצא בממשק עם יחידות המשנה האחרות (תרשים 5, c,d). בהינתן זאת יכולה שארית הגלוטמין 256 לשחק תפקיד בייצוב המכלול ובאטרקציה ולהעביר את המולקולות, אשר הועברו, או אשר עברו בחלבונים נשאים, ואשר הובלו (כסודיום).

דיון
אנו מציגים פה שתי מטופלות, שאין קשר ביניהן, הסובלות מעיכוב התפתחותי כללי מובהק, ממיקרוצפליה פרוגרסיבית, מפרכוסים ומספסטיות. שתי המטופלות אף חולקות מאפיינים התנהגותיים דומים: רגזנות, היפראקטיביות, הפרעת שינה וסטריאוטיפים וכמו-כן ממצאי דימות: דלדול מוחי ו- CCדק. בשני המקרים לא הניב סידור שלישיית אקסונים ברצף שום אבחנה, כי אם הצליב את הנתונים ביניהן, שיקף תורשת מוטציות נסגנית פוטנציאלית, אשר קשורה לכרומוזומים, שאינם כרומוזומי מין, בגן ה-SLC1A4. מטופלת אחת הייתה הומוזיגוטית למוטציית ה-c.766G>A, p.(E256K), הקשורה להחלפת חומצות אמינו, והשנייה הייתה הטרוזיגוטית למוטציה זו ולמוטציית ה-c.945delTT, p.(Leu315Hisfs*42) חסרת המשמעות.

נמצא, כי המוטציות היו נדירות למדי בבסיסי נתונים אחדים של האוכלוסייה הכללית ובאמצעי החיזוי הרבים כניתוח מבני, התומך בפתוגניות שלהם. גילוי שתי המוטציות השונות בגן ה-SLC1A4 בקרב שתי מטופלות בעלות פנוטיפ דומה, שאין קשר ביניהן, מציין חד וחלק, כי בעצם, הגן, הוא זה אשר גורם ללקות בשני המקרים.
כמתואר בשיטות. מודל מבני של יחידת המשנה המבודדת מופיע (a), צבוע על-ידי מבנים משניים. הניבוי הוא, כי המוטציה (E256K) ממוקמת לצד סליל ממברנה ארוך. (b) המוטציה, אשר עברה שינוי מסגרת, מחוללת שינוי ברצף 41 חומצות האמינו, הנלווה לאזור המוטציה (צבוע באדום, חומצות האמינו 315-355), עד אשר היא נעצרת בקודון חסר מסגרת. יתר החלבון (צבוע בכחול, חומצות האמינו 356-523) קצוץ, מה שהגיוני מכל, כי מוביל לאי ספיגה ראויה של החלבון, למצב לא פונקציונלי. (c) החלבון הבשל ודאי מסגל לעצמו מצב סימטרי , שאינו בר השוואה לאחר, סביר מכל, כי זהו טרימר, כאשר הצפי הוא, כי E256 ממוקם סמוך לממשק. (d) צפייה מהצד במצב המורכב, כשמישור הממברנה קובע, כי E256 קרוב לצד הציטופלזמי. בכל הפנלים מופיע מיקום ה- E256בשחור ובייצוג, המאפיין אותו.

מונח זה מאושש הרבה יותר באמצעות המתאם בין חומרת הפנוטיפ לבין השפעת מוטציית ה-SLC1A4: כלומר המטופל, אשר נושא את המוטציה, אשר עברה שינוי מסגרת, מושפע בחומרה רבה יותר מהמטופל ההומוזיגוטי למוטציה, הקשורה להחלפת חומצות אמינו.

בעת סיום הדיווח הזה עודדנו את בעבודתה של הקבוצה של Michaud, אשר פורסמה באינטרנט זה עתה (3). הם מדווחים על שני אחים בני הורים אשכנזים, אשר מפגיניםID , מיקרוצפליה פרוגרסיבית, ספסטיות ו-CC דק בדימות תהודה מגנטית (MRI). נמצא, לפי סידור ברצף של הגנום האנושי כולו, כי הם הומוזיגוטיים לאותה מוטציה, הקשורה להחלפת חומצות אמינו, c.766G>A, p.(E256K), אשר תוארה פה על-ידינו. לאור העובדה, כי הם מתארים רק מוטציה הומוזיגוטית אחת, הקשורה להחלפת חומצות אמינו, בגן הזה, המשותף לאחים, הם מציעים, כי יש לאתר עוד מטופלים כדי לוודא, מה תפקיד ה- SLC1A4כגן, אשר גורם למחלה. הממצאים הבלתי תלויים שלנו, אשר נמצאו בקרב שני מטופלים נוספים, אשר אינם קשורים זה לזה, בעלי פנוטיפ דומה ובעלי מוטציה חדשה מזיקה מאד של גן ה- SLC1A4, מאששים את הסברה, כי זה, למעשה, גורם חדש להפרעה נוירו-התפתחותית חדשה. הן המטופלות שלנו והן האחים, המתוארים על-ידי Srour ושות’ (3), מפגינים ID מובהק, מיקרוצפליה פרוגרסיבית לאחר הלידה, ספסטיות ואף מאפייני MRI דומים: CC דק ועיכוב בהעברת המיאלין (טבלה 1). הדמיון הרב בפנוטיפ הקליני מרמז, על כך שכל המאפיינים דלעיל מהווים רכיבים ייחודיים של הפרעה נוירו-התפתחותית חדשה זו. מתוך המטופלים שלנו שתי האחיות האשכנזיות הפגינו פרכוסים מלווים בחום, בעוד המטופלת ההטרוזיגוטית, הפגועה קשה יותר, סובלת מדי יום ביומו מפרכוסים חסרי גירוי. אחד האחים, המתוארים על-ידי Srour ושות’ (3), מפגין אף הוא פרכוסים מלווים בחום, בעוד האחר לא חווה פרכוסים משום סוג שהוא.
הדבר מציע, כי אפילפסיה, או פרכוסים מלווים בחום, עלולים להתרחש, עם זאת הם אינם רכיבים מחייבים של הפרעה זו.
בעת בחינת שכיחות של שתי מוטציות ה-SLC1A4 לא נמצאה מוטציית ה-c.945delTT, p.(Leu315Hisfs*42) באף אחד מבסיסי הנתונים של האוכלוסייה הכללית, אשר נבדקו, גם לא בקרב חברי קבוצת הביקורת יוצאי עראק. משתנה ה- c.766G>A,p.(E256K), הקשור להחלפת חומצות אמינו, נמצא נדיר עד מאד בבסיסי הנתונים של האוכלוסייה הכללית, יחד עם זאת אף על-פי שלא נמצא באף אחד מ-256 האללים (128 מטופלים) של פרויקט הגנום האשכנזי כולו, הוא לא הוסתר באופן הטרוזיגוטי בקרב 1/100 חברי קבוצת הביקורת האשכנזים. נתונים אלה בשילוב עם תדירות דומה של 5 הטרוזיגוטים מתוך 450 חברי קבוצת ביקורת אשכנזים, כמדווח על-ידי הקבוצה של Michaud (3), מציעים מוטציה מכוננת אשכנזית אפשרית בלוויית שיעור נשאים גבוה יחסית של תחליף ה-c.766G>A.

לכן אנו סבורים, כי ניתוח ספציפי של מוטציית ה-SLC1A4 אמור להילקח בחשבון בקרב כל מטופל אשכנזי, המפגין מערך תסמינים וממצאי MRI. מעשה זה עשוי להוביל לאבחון מקרים נוספים. למעלה מכך, אם שיעור נשאים זה, הגבוה יחסית בקרב יהודים אשכנזים, יאושר גם במחקרים אודות אוכלוסייה נרחבת יותר, כדאי להביא בחשבון תוספת של מוטציית c.766G>A, p.(E256K), הקשורה להחלפת חומצות אמינו, בגן ה-SLC1A4 לטובת תכניות מיסוך גנטי לאומיות.

ה-SLC1A4 מקודד למען מוביל ה- ASCT1 Na-dependentשל חומצות האמינו, אלנין-L, סרין-L, ציסטאין-L ותראונין-L (17). מקרב חומצות האמינו הניטרליות היא החיונית מכולן להעברת סרין-L, בעת שאין מובילים חלופיים יעילים במערכת העצבים המרכזית. אף שקיימות כמה מחלוקות בנוגע לביטוי הזמני הספציפי שלה, נראה, כי ASCT1 מתבטא באסטרוציטים ובאותה מידה בנוירונים ונחשב לבעל תפקיד מפתח בהעברת ה- סרין-L במחסום בדם ובמוח, מהאסטרוציטים אל החלל החוץ תאי ואל הנוירונים (18–20). סרין-L ידוע כמקדם במידה רבה את הישרדות הנוירונים, את צמיחתם ואת ההבדלה ביניהם ואף הערכה מסתעפת וסינפטוגנזה מסתעפת. אף כי הוא נחשב לחומצת אמינו, שאינה נחוצה, נראה, כי 3-phospo-glycerate-dehydrogensase, אנזים המפתח בביו-סינתזה של ה- סרין, מבוטא בתאי אב קדמון נוירוני בשעת התפתחות העובר, בצד זאת לא בנוירונים בשלים לאחר ההבדלה הסופית ביניהם באזור, שבו מתפתחים חידקים במהירות (21).

לפיכך בעת ההבדלה תלויים הנוירונים באסטרוציטים רדיאליים מסוג גלייה בעניין הוספת ה-סרין במוביל ה-ASCT1. תלות זו בהעברת הסרין מהאסטרוציטים יכולה להסביר את מאפייני ה-ID הדומים, מיקרוצפליה חמורה וספסטיות בקרב המטופלים שלנו ומצב של מחסור בסרין בעקבות פגם בביו-סינתזה שלו (22). תפקוד הסרין כגורם תזונתי עוצמתי בנוירונים (19) יכול להוות עילה ל-ID ולמיקרוצפליה, המופגנת בהימצא לקויות אלו, ותפקידה בסינתזה של הליפידים של הממברנה, כגון phosphatidyl-l-serine וכגון sphingolipids (19), יכול להסביר את המחסור בחומר הלבן ב- MRIשל המטופלים. מצד שני, ביטוי ה- 3-phospo-glycerate-dehydrogensase בנוירונים העובריים עשוי להבהיר, מדוע המיקרוצפליה בהפרעות המחסור בסרין מולדת, בעוד ב-SLC1A4 היא מתפתחת לאחר הלידה. הבדל אחר בין הפנוטיפים נעוץ בנטייה לפרכוסים מלווים בחום, הנראית, הן בקרב המטופלות שלנו והן בקרב אחד האחים, המתוארים על-ידי הקבוצה של Michaud (3).

הדבר יכול להתקשר לטמפרטורה, שנקבעה לתלות בהעברת הסרין על-ידי ה-ASCT1, הן בנוירונים והן באסטרוציטים (20). פרט לתפקוד החשוב שלו במוח, מובע ה-ASCT1 ברקמות אחרות, דוגמת הכליה, דוגמת המעי ודוגמת הכבד (17). הבעתו בהפטוציטים יכולה להתקשר לעליות זמניות שלהם בטרנסמינים, אשר חלו בקרב שני האחים האשכנזים, אשר עליהם דווח פה. למרות זאת עדין נותר לראות, אם תופעה זו חוזרת בקרב מטופלים נוספים, ואם משום כך היא מהווה, הלכה למעשה, מאפיין נוסף של הליקוי.

הדמיון הקליני הקרוב של הפרעה חדשה זו לליקוי המחסור בסרין והפתוגניות המשוערת השכיחה קשור למחסור בסרין בנוירונים, המעלה את השאלה לגבי גישה טיפולית אפשרית, המתבססת על הוספת סרין. נראה, כי בעתות הוספת סרין היא יעילה להפחתת תדירות הפרכוסים ולשיפור בהעברת המיאלין במוח. הוספת סרין זו לפני הלידה עשויה לתקן את כל הפנוטיפ (22).

אם כי יש אפשרות לסבור, כי הוספה חיצונית חסרת ערך בהתקיים פגם במוביל, אם הסרין אינו מסוגל לחלחל אל הנוירונים. בניגוד לכך נגרס, כי ASCT1 וכי 3-phospo-glycerate-dehydrogensase מבוטאים יחדיו וכי נוירונים בשלים, אשר אינם מבצעים סינתזה בסרין, גם לא מבטאים את מוביל ה- ASCT1(21). מסיבה זו אפשר לגרוס, כי מנגנון שונה משמש לספיגת סרין בנוירונים הבשלים וכי הפתולוגיה העיקרית בהפרעת ה-SLC1A4 נובעת משחרור לקוי של סרין אל החלל החוץ תאי על-ידי ה-ASCT1 של האסטרוציטים. אם זה המקרה, אזי בפועל יכולה הוספת סרין להועיל במידה רבה. יתרה מזאת היא יכולה אפילו להניב תוצאה טובה יותר, בהשוואה לסינדרומים של המחסור בסרין בגין ייצור הסרין הריבוני בעזרת נוירונים עובריים ובעזרת הופעת סימני נזק לנוירונים (על דרך המשל, מיקרוצפליה), לאחר הלידה בלבד. מחקר עתידי נועד לאפיין את תגובת הפיתוח השלילי של ה-SLC1A4 ואת תגובת הנוירונים הבשלים למחסור חיצוני בסרין ולהוספתו.

לסיכום, אנחנו מציגים פה הוכחה לתפקיד ה- SLC1A4בתור גן חדש, הגורם למחלות, להפרעה נוירו-מטבולית חדשה, המאפיינת ID מובהק, מיקרוצפליה פרוגרסיבית לאחר הלידה, ספסטיות, שינויים בחומר הלבן, ובמקרים מסוימים הפרעת פרכוסים. דמיון בפנוטיפ ודמיון רדיולוגי לסינדרומים של המחסור בסרין ולפתומכניזם, המיועד לכך, בהתבסס על העברת סרין לקויה מהאסטרוציטים אל החלל החוץ תאי, מעלה את השאלה אודות גישה טיפולית אפשרית תוך שימוש בהוספת סרין.

ליקוי מרתק זה יכול להיות חשוב באופן מיוחד באוכלוסייה הכללית היהודית האשכנזית מפאת שיעור נשאים גבוה יחסית של מוטציית c.766G>A, p.(E256K), הקשורה להחלפת חומצות אמינו, ב- SLC1A4ורצוי להפעיל שיקול דעת לגבי אתניות אפשרית, הנוגעת למיסוך, בייחוד בהימצא טיפול פוטנציאלי.

0 / 5. 0

דילוג לתוכן